紫杉烷9α-羥基化酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、紫杉醇(Taxol)是一種著名的具有多種抗癌療效的化合物，最早從紅豆杉樹皮中提取獲得。尋找紫杉醇合成途徑中的關(guān)鍵酶基因能為規(guī)?；a(chǎn)紫杉烷類藥物奠定理論基礎(chǔ)，紫杉烷9α-羥基化酶就是關(guān)鍵酶中的一個(gè)，多年來該基因序列一直沒能在紅豆杉中找到，說明直接從紅豆杉中克隆此基因的難度很大。研究發(fā)現(xiàn)銀杏（Ginkgo biloba）懸浮細(xì)胞能特異性地對(duì)2α，5α，10β，14β-四乙酰氧基-紫杉-4(20)，11-二烯(sinenxan A，縮寫SI

2、A)進(jìn)行9α羥基化，表明銀杏細(xì)胞含有紫杉烷9α-羥基化酶的活性，這啟示如果找到銀杏中紫杉烷9α-羥基化酶(taxoid9alpha-hydroxylase)編碼基因，就有望發(fā)現(xiàn)紅豆杉細(xì)胞中紫杉烷9α-羥基化酶，從而完善紅豆杉紫杉醇生物合成這一重要代謝途徑。本研究分析了銀杏細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)信息，找到了與CYP450高度同源的紫杉烷羥基化酶候選基因15個(gè)，并克隆了其中的兩個(gè)基因，分別構(gòu)建表達(dá)載體，進(jìn)行蛋白表達(dá)、酶促反應(yīng)以及LC-M

3、S鑒定，成功得到銀杏9α-羥基化酶基因，在此基礎(chǔ)上，開展了通過類似手段從南方紅豆杉細(xì)胞中尋找紫杉烷9α-羥基化酶基因的嘗試。主要研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果如下:
　　 (1)以銀杏組培細(xì)胞為材料，通過CTAB法提取總RNA，再消除DNA污染，得到純度較高的RNA;
　　 (2)克隆得到同源性最高的前兩個(gè)基因Contig5926和Contig5382，其中Contig5926屬于CYP725家族，全長(zhǎng)1775 bp，編碼504個(gè)氨

4、基酸;Contig5382屬于CYP716家族，全長(zhǎng)1899 bp，編碼486個(gè)氨基酸;
　　 (3)為表達(dá)蛋白，構(gòu)建了Contig5926的酵母表達(dá)載體和無細(xì)胞表達(dá)(CFS)載體以及Contig5382的CFS表達(dá)載體，隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定和酶促反應(yīng);
　　 (4)先后通過HPLC和液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS)分析，鑒定出Contig5382基因表達(dá)的蛋白具有紫杉烷9α-羥基化酶的活性，且產(chǎn)物保留時(shí)間是31.8