盾殼霉鐵載體鐵轉(zhuǎn)運類似蛋白CmSIT1功能研究.pdf

1、盾殼霉（Coniothyrium minitans）能夠寄生核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）的菌絲和菌核，可以產(chǎn)生少量的抗真菌物質(zhì)，是菌核病的重要生防真菌。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化盾殼霉分生孢子的方法，得到20多株表型明顯有別于野生菌株ZS-1的突變體。其中ZS-1TN1812菌落異常，顏色由黃色向棕色漸變發(fā)展，菌落形狀不規(guī)則呈扇形;在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長緩慢，菌絲尖端短分枝明顯增多，菌落中央菌絲明顯變粗;該

2、突變體菌落能產(chǎn)生分生孢子器，但不產(chǎn)生分生孢子，而ZS-1菌株的典型表型則是菌絲表面逐漸被黑色分生孢子器覆蓋;并且ZS-1TN1812在PDA平板上與核盤菌對峙培養(yǎng)時能夠產(chǎn)生大量抗真菌物質(zhì)。通過溫度和蛋白酶處理ZS-1TN1812發(fā)酵濾液，發(fā)現(xiàn)抗真菌物質(zhì)至少包含耐熱型和蛋白酶敏感型兩種化合物。耐熱型抗真菌物質(zhì)可以特異性抑制核盤菌的生長，但不能抑制另一種真菌希金斯刺盤孢菌的生長。而與核盤菌相比，希金斯刺盤孢菌則對有蛋白活性的抗菌物質(zhì)更為敏感

3、。為了探究ZS-1TN1812濾液中抗真菌物質(zhì)對菌核病的防治效果，噴灑其濾液于油菜葉片上，核盤菌的侵染擴展明顯受到抑制，說明該突變體產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)在油菜葉片上能發(fā)揮有效作用，可以達到防治菌核病的目的。
　　突變體ZS-1TN1812中T-DNA的單拷貝插入激活了鐵載體鐵轉(zhuǎn)運蛋白類似基因CmSIT1的表達，而且CmSIT1在盾殼霉中是單拷貝存在的。CmSIT1基因包含一個大小為2510bp的開放閱讀框，由7個外顯子，6個內(nèi)含子組成

4、，編碼區(qū)序列長度為2052bp，編碼683個氨基酸（GenBank登錄號:MF447899）。為了預(yù)測此基因的功能，經(jīng)NCBI網(wǎng)站Blastp搜索CmSIT1含有一個保守結(jié)構(gòu)域(aa124-aa490)，屬于主要運輸超家族MFS家族，TMHMM Server v.2.0預(yù)測CmSIT1具有13個跨膜區(qū)域，用軟件Phyre2采用同源建模的方法構(gòu)建了CmSIT1的三維結(jié)構(gòu)模型，構(gòu)建進化樹分析，結(jié)果表明CmSIT1極有可能是用于鐵吸收的MFS

5、轉(zhuǎn)運載體，該基因推定可能與鐵載體介導(dǎo)的鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)。同時在盾殼霉中超量表達CmSIT1基因，轉(zhuǎn)化子獲得與ZS-1TN1812相似的表型，說明ZS-1TN1812的異常表型確實是CmSIT1基因增強表達導(dǎo)致的。為了進一步驗證此基因的功能，本研究運用試劑盒定量檢測了盾殼霉菌絲中鐵離子的總含量，發(fā)現(xiàn)ZS-1TN1812菌絲中鐵離子總含量顯著高于ZS-1，說明ZS-1TN1812吸收鐵離子的能力增強。突變體ZS-1TN1812和野生型菌株ZS-1

6、在含2mM FeCl3的PDA平板上培養(yǎng)，兩菌株吸收鐵的能力都明顯增強而且表型基本相同，說明菌絲內(nèi)鐵的高度積累與突變體ZS-1TN1812的異常表型二者是相關(guān)的。為了探索ZS-1菌株中CmSIT1基因被誘導(dǎo)表達的條件，將ZS-1菌株與其他真菌共培養(yǎng)，然后qRT-PCR分析CmSIT1基因的動態(tài)表達變化，發(fā)現(xiàn)ZS-1菌株與核盤菌互作早期(2d)時，ZS-1中能檢測到CmSIT1基因的大量表達，4d和5d時，其表達顯著下滑，表明CmSIT1

7、可能在與核盤菌互作早期發(fā)揮作用，比如與寄主核盤菌競爭鐵離子?？傊?，突變體ZS-1TN1812的異常表型跟菌絲內(nèi)鐵的高度積累是相關(guān)的，CmSIT1基因可能與鐵載體介導(dǎo)的鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)，其激活表達增強了盾殼霉的抗真菌能力，此基因在盾殼霉與核盤菌互作早期可被強烈誘導(dǎo)表達，是一個潛力很大的可以提高盾殼霉生物防治能力的基因。
　　為了闡明CmSIT1基因調(diào)控盾殼霉生長、產(chǎn)孢和抗真菌作用等的分子機制，本研究對ZS-1TN1812和ZS-1的48h

8、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了分析。GO和Pathway富集的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異表達的基因涉及到的都是生物體生命活動中十分重要的過程，如碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運、免疫系統(tǒng)等。CmSIT1基因的上調(diào)表達，影響最大的基因主要是跟代謝進程相關(guān)的類別包括碳水化合物和脂類代謝等基礎(chǔ)代謝，說明CmSIT1基因是盾殼霉的重要基因，該基因的變化會影響盾殼霉最基礎(chǔ)的生命代謝活動，如生長、產(chǎn)孢等。為了進一步研究盾殼霉中發(fā)揮抗菌作用的物質(zhì)種類，本研究運用GC-MS和LC

9、-MS技術(shù)對菌絲粗提液的代謝物質(zhì)進行了測定，檢測出ZS-1樣品化合物種類主要有酮類、烷烴、烯烴、酯類和脂肪酸類等，ZS-1TN1812樣品化合物種類主要有醇類、萜類（倍半萜和單鏈萜）、烷烴、烯烴、酯類、脂肪酸類和生物堿類等。通過兩者鑒定物質(zhì)種類對比，抗菌物質(zhì)有可能是萜類化合物、類固醇、生物堿類物質(zhì)。烷烴、烯烴、醇類參與碳水化合物的代謝，酮類、萜類、酯類和脂肪酸類參與脂質(zhì)代謝，生物堿類屬于次級代謝產(chǎn)物。通過根據(jù)差異代謝物質(zhì)與代謝通路的交叉

10、分析對比，發(fā)現(xiàn)二者具有對應(yīng)關(guān)系。代謝組鑒定出的主要化合物可以歸入相應(yīng)的Pathway富集類別:(1)碳水化合物代謝（環(huán)十六烷、正十八烷、二十二烷、二十七烷、二縮甘露醇、山梨醇、D-甘露醇等）、(2)脂類代謝[脂肪酸和不飽和脂肪酸的生物合成（亞油酸、油酸、麥角固醇、合金歡醇）、甘油磷脂代謝、醚脂類代謝（丁基-異丁基-鄰苯酸二甲酯、鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯、鄰苯二甲酸二丁酯）、多酮類化合物（環(huán)戊基乙酮）和萜類化合物（古蕓烯、角鯊烯）的

11、代謝]、(3)次級代謝產(chǎn)物[包括4-甲基-2，6-二喹啉二醇、2-(2-苯并噻唑基硫代)乙醇等生物堿]。而且通過代謝節(jié)點與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的相互驗證（例如糖類和過氧化氫的代謝等），推測代謝節(jié)點相關(guān)的基因和酶類的變化可能是導(dǎo)致ZS-1TN1812異常表型的部分原因。
　　綜上所述，本研究盾殼霉中CmSIT1基因的激活表達能夠影響盾殼霉的生長、產(chǎn)孢和重寄生能力，使其產(chǎn)生大量抗真菌物質(zhì)。鐵載體鐵轉(zhuǎn)運蛋白(SIT)是真菌中特有的且具有底物特異性