盾殼霉氮代謝調(diào)控基因cmareA的功能研究.pdf

1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary）是油菜菌核病的病原菌，每年造成油菜大量減產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)損失巨大。重寄生真菌盾殼霉（Coniothyrium minntans）對(duì)核盤菌專性寄生，對(duì)核盤菌的生物防治有著廣闊的開發(fā)前景。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)盾殼霉能降解核盤菌產(chǎn)生的草酸毒素，這一過程中可以通過產(chǎn)生氨來緩解酸化的環(huán)境，也說明這其中伴隨著盾殼霉的氮源代謝調(diào)控，而參與該氮源代謝的調(diào)控基因和功能還未見報(bào)道。

2、盾殼霉氮源代謝調(diào)控基因（cmareA）對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育，盾殼霉重寄生，降解草酸和產(chǎn)生抗真菌的影響也尚不清楚。因此，該課題在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)盾殼霉的氮源代謝調(diào)控基因cmareA進(jìn)行了深入研究，獲得的主要研究成果如下:
　　從盾殼霉Chy-1中克隆獲得cmareA部分序列，比對(duì)盾殼霉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得全部cmareA基因序列，基因全長(zhǎng)2811 bp，除去一個(gè)內(nèi)含子之后的外顯子序列大小為2754 bp，該開放閱讀框編碼917個(gè)氨基酸

3、。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明cmareA編碼的氨基酸與小麥穎枯病菌（Parastagonospora nodorum）的同源areA編碼的氨基酸親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)85％。基因的表達(dá)分析證明cmareA基因只有在優(yōu)先氮源不足或氮源饑餓狀態(tài)下，cmareA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控才會(huì)被激活，cmareA基因才會(huì)表達(dá)。
　　通過Split-Marker技術(shù)對(duì)cmareA基因進(jìn)了敲除與互補(bǔ)，獲得敲除突變體△cmareA-129和△cmareA-133

4、，相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子△cmareA-129C和△cmareA-133C。對(duì)其生物學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，cmareA的缺失會(huì)減慢盾殼霉在PDA培養(yǎng)條件下的菌絲生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)會(huì)減低其產(chǎn)孢量。另外，cmareA的缺失會(huì)導(dǎo)致盾殼霉在以硝酸和銨鹽為氮源的MCD培養(yǎng)條件下的菌絲生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)速率顯著下降。
　　通過平板對(duì)峙試驗(yàn)和菌核沙皿寄生菌核試驗(yàn)，測(cè)定各突變體寄生核盤菌的能力。結(jié)果顯示，cmareA敲除后，敲除轉(zhuǎn)化子△cmareA-129和

5、△cmareA-133對(duì)核盤菌菌絲和菌核的寄生能力減弱。進(jìn)一步測(cè)定重寄生相關(guān)酶（胞外蛋白酶、葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶）活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除突變體的重寄生能力的減弱可能是由于cmareA缺失導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶活性降低所引起的。通過液相色譜的方法，測(cè)定各突變體降解草酸的能力，結(jié)果顯示，cmareA缺失后盾殼霉降解草酸的能力也同樣減弱。在不同氮源的培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)可能由于cmareA敲除突變體的生長(zhǎng)速度減慢導(dǎo)致產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)的能力也有不同程度的降低。另外，