盾殼霉胞外蛋白酶特性、分離純化及其生防作用評估.pdf

1、盾殼霉是防治核盤菌的重要生防菌。在盾殼霉寄生核盤菌的過程中會分泌多種胞外酶，包括葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶。前人已對盾殼霉產(chǎn)生葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶及其生防作用進(jìn)行了許多研究，但對盾殼霉產(chǎn)生蛋白酶及其生防作用尚未見報道。為了明確蛋白酶在盾殼霉寄生核盤菌中的作用，本課題開展了對盾殼霉產(chǎn)生胞外蛋白酶的條件、盾殼霉蛋白酶基本酶學(xué)性質(zhì)、蛋白酶分離純化、以及蛋白酶粗提物對核盤菌菌絲和原生質(zhì)體的作用效果等方面進(jìn)行了研究。
　　 比較了馬鈴薯葡萄

2、糖培養(yǎng)液(PDB)、馬鈴薯培養(yǎng)液(PB)、核盤菌菌核提取物培養(yǎng)液(Ss)、馬鈴薯菌核提取物培養(yǎng)液(PBSs)、馬鈴薯葡萄糖菌核提取物培養(yǎng)液(PDBSs)5種培養(yǎng)基對盾殼霉胞外蛋白酶產(chǎn)量影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ss培養(yǎng)液適合盾殼霉產(chǎn)生蛋白酶。結(jié)果還表明：葡萄糖不利于盾殼霉產(chǎn)生蛋白酶。
　　 采用福林酚法對盾殼霉胞外蛋白酶活性進(jìn)行了定量測定，并研究了影響盾殼霉蛋白酶活性的因子。結(jié)果表明：盾殼霉蛋白酶活性最適溫度為60℃，最適pH值為7。在40

3、℃以下保存，蛋白酶穩(wěn)定；一些金屬離子，包括Na+、K+、Li+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+和Mn2+等(5mM)對盾殼霉蛋白酶酶活沒有影響；而Fe2+(5mM)對盾殼霉蛋白酶活性發(fā)揮具有明顯的促進(jìn)作用；當(dāng)Fe2+濃度達(dá)到250mM時，盾殼霉蛋白酶活性發(fā)揮受到顯著抑制。盾殼霉蛋白酶對苯甲基磺酰氟(PMSF)非常敏感，說明盾殼霉產(chǎn)生的蛋白酶可能是一種絲氨酸蛋白酶。
　　 經(jīng)過硫酸銨沉淀、透析后的樣品，通過Q sephar

4、ose Fast Flow陰離子交換層析后，純度有所提高，但仍未達(dá)到電泳純，收集管中可以檢測到蛋白酶的活性，為0.3U/ml，經(jīng)過超濾，通過HiPrep16/60 sephocryl s-100 High Resolution層析后，雖達(dá)到電泳純，但未檢測到蛋白酶活性，問題的原因還有待進(jìn)一步探討。
　　 經(jīng)過Q sepharose Fast Flow層析收集液，檢測到蛋白酶活性的收集管，處理核盤菌菌絲和原生質(zhì)體，可以降解核盤菌的