標準化日本血吸蟲病金標診斷試紙的臨床研究.pdf

1、目的:
　　本課題的目的旨在:通過對標準化日本血吸蟲病金標診斷試紙進行臨床研究,以評價其臨床適用性、穩(wěn)定性及應(yīng)用價值,為日本血吸蟲病的診斷提供一種理想的診斷試劑。
　　目前,我國沿長江流域的湖南、湖北、江西、安徽和江蘇等地,仍是日本血吸蟲病流行疫區(qū),因受洪水等自然災(zāi)害因素、南水北調(diào)工程的影響,其疫區(qū)漸有擴大趨勢。面對如此嚴峻的日本血吸蟲病疫情,在采取綜合防治的同時,其診斷工作首當(dāng)其沖。因為日本血吸蟲病診斷的正確與否,可直接影

2、響到該病疫情的真實性,乃至防治工作計劃的制定、實施和防治效果的評價等諸多環(huán)節(jié)。因此,研發(fā)一種理想的診斷試劑,對于我國日本血吸蟲病的防治工作顯得十分重要。
　　在我國,日本血吸蟲病的病原學(xué)診斷和免疫學(xué)診斷已被視為該病個體或群體化療對象的確定,化療、預(yù)防和傳播控制效果,以及傳播控制或阻斷效果的評價依據(jù)。
　　迄今為止,日本血吸蟲病病原學(xué)診斷,仍是該病確診的唯一標準,其依據(jù)是能夠從日本血吸蟲流行疫區(qū)人群糞便中檢出日本血吸蟲蟲卵或孵

3、化出毛蚴,及直腸粘膜活體組織檢出蟲卵等。常見的病原學(xué)診斷方法有:直接涂片法、毛蚴孵化法、定量透明法、直腸粘膜活體組織檢查等。隨著近年來疫區(qū)人群感染率及感染程度的大幅下降,以及漏診率高、操作繁瑣、受檢者依從性低等現(xiàn)象的突出,病原學(xué)診斷應(yīng)用范圍日益縮小。
　　與之相反,隨著現(xiàn)代免疫學(xué)、分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的不斷發(fā)展,可用于日本血吸蟲病輔助診斷的免疫學(xué)診斷方法及其應(yīng)用領(lǐng)域愈發(fā)廣泛。常見的免疫學(xué)診斷方法多以檢測血清中特異性抗體為主,如間

4、接血凝試驗(IHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。
　　然而根據(jù)IHA及ELISA研發(fā)的日本血吸蟲病診斷試劑,多存在反應(yīng)時間長、需要特殊設(shè)備、價格較為昂貴等缺點,難以滿足基層及現(xiàn)場篩查的特殊需求。尤其是以上診斷試劑不具備標準化生產(chǎn)及質(zhì)量控制體系,更是與理想診斷試劑的標準相差甚遠。
　　世界衛(wèi)生組織(WHO)曾對理想診斷試劑提出以下要求:理想的診斷試劑應(yīng)具備完善的標準體系、靈敏度高、特異性強、操作簡捷、便于運輸和保存,可

5、用于病例診斷或篩查、流行病學(xué)調(diào)查、疾病監(jiān)測以及抗藥性監(jiān)測等。
　　為研制符合WHO要求的日本血吸蟲病理想診斷試劑,本課題組采用無種屬特異性、具有高穩(wěn)定性及活性的膠體金標記葡萄球菌A蛋白(SPA)作為顯色體系,結(jié)合具有免疫反應(yīng)與色譜層析優(yōu)點的免疫層析技術(shù),建立了一種快捷、簡便的日本血吸蟲病金標診斷試紙。在此基礎(chǔ)上,又對已研制的金標試紙從原料、產(chǎn)品生產(chǎn)等各個環(huán)節(jié)予以標準化制備及質(zhì)量控制,完善了日本血吸蟲病金標診斷試紙的各環(huán)節(jié)標準化體系

6、。標準化的日本血吸蟲金標診斷試紙在實驗室研發(fā)階段,既體現(xiàn)出靈敏度高、特異性好、快捷簡便、價格低廉等獨特優(yōu)越性。為驗證其能夠有效應(yīng)用于日本血吸蟲病的臨床診斷,現(xiàn)將標準化日本血吸蟲病金標診斷試紙進行臨床研究,以評價其臨床適用性、穩(wěn)定性及應(yīng)用價值,為日本血吸蟲病的診斷提供一種理想的診斷試劑。
　　方法:
　　1.日本血吸蟲病金標診斷試紙標準體系
　　1.1日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(Sj-SEA)標準
　　取1300～1

7、500條尾蚴感染新西蘭兔(2.5±0.5 Kg)45天,提取肝臟內(nèi)Sj-SEA;二喹啉甲酸(BCA)法測定其蛋白含量(5mg/mL);ELISA法檢測 Sj-SEA免疫活性(Sj-SEA為1.25μg/ml和血清稀釋度1:200)。1.2抗體標準
　　日本血吸蟲病患者血清(Sj-S)50例(病原學(xué)和免疫學(xué)陽性);交叉反應(yīng)抗體血清(病原學(xué)和免疫學(xué)陽性)80例,其中包括肝吸蟲病20例、肺吸蟲病15例、旋毛蟲病15例、鉤蟲病15例和囊蟲

8、病15例;正常人血清50例。上述血清行艾滋病、肝炎檢測均為陰性。
　　1.3膠體金標準化
　　膠體金含量為1％,顆粒直徑為25nm。
　　1.4試紙包被標準
　　質(zhì)控線:0.5mg/ml抗SPA二抗,線寬1.0mm;
　　檢測線:1.4mg/mlSj-SEA,線寬1.0mm。
　　1.5試紙成品標準
　　試紙陽性結(jié)果應(yīng)為質(zhì)控線及檢測線均出現(xiàn)紅色條帶,陰性結(jié)果則僅質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶;試紙成品檢測標

9、準抗體血清,應(yīng)達到以下標準:
　?、訇栃詸z出率:急性感染日本血吸蟲病人群檢出95％以上,慢性日本血吸蟲病人群檢出90％以上;
　?、诮徊娣磻?yīng)率:與常見寄生蟲感染性疾病交叉反應(yīng)率為5％以下;
　　③假陽性率:正常人陽性檢出率(假陽性)為1％以下。
　　2.標準化日本血吸蟲病金標診斷試紙臨床研究
　　2.1樣本來源
　　參照《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》對臨床研究單位的要求,本研究所用血清樣本由荊州

10、市血吸蟲病?？漆t(yī)院、潛江市血吸蟲病預(yù)防控制所、武漢市蔡甸區(qū)血吸蟲病防治所三家血吸蟲病專科防治單位提供。
　　2.2樣本數(shù)量及選取標準
　　本次臨床研究共收集1026例血清樣本,其中100例非疫區(qū)健康人血清,926例病原學(xué)陽性血吸蟲病患者血清(急性感染患者血清67例、慢性感染患者血清816例、晚期患者血清43例)。
　　選取標準:根據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》﹑《中華人民共和國傳染病防治法實施辦法》﹑中華人民共和國衛(wèi)

11、生行業(yè)標準《血吸蟲病診斷標準》(WS261-2006),分別選取血吸蟲流行疫區(qū)急性﹑慢性﹑晚期不同感染階段病人血清及非疫區(qū)人群血清,樣本信息均含有受試者病原學(xué)檢測結(jié)果及流行病學(xué)資料。
　　2.3方案設(shè)計
　　采用隨機﹑單盲法進行臨床研究。將上述1026例已知病原學(xué)檢測結(jié)果的血清打亂次序、重新編號,并分裝至于-20℃保存,應(yīng)用標準化日本血吸蟲金標診斷試紙進行檢測,試驗結(jié)束后揭盲。試驗項目:①試紙檢測結(jié)果與金標準(病原學(xué)檢測)結(jié)

12、果進行比較,評價該試紙的臨床適用性;②試紙與已上市同類試劑“日本血吸蟲抗體檢測試劑盒(MPAIA)”進行同步對比試驗,觀察試紙與已上市診斷試劑的等效性;③長期試驗,選666例血清(其中566例陽性血清、100例陰性血清),分別用于室溫保存0個月、4個月、8個月及12個月的試紙檢測,以觀察試紙在室溫下長期保存的穩(wěn)定性;④加速試驗,選74例血清(其中64例陽性血清、10例陰性血清),分別用于37℃溫箱保存0個天、1天、2天、4天、6天及7天

13、的試紙檢測,以觀察試紙高溫保存下的穩(wěn)定性。
　　2.4臨床研究考核
　　嚴格執(zhí)行標準操作程序，所有實驗室檢測均由同一人員完成，并詳細記錄試驗過程及結(jié)果;采用靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率、約登指數(shù)、調(diào)整一致率、kappa值等指標考核該試紙的臨床適用性;采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件及卡方檢驗考核試紙的等效性;采用靈敏度、特異度及一致率的散點趨勢圖考核試紙的長期穩(wěn)定性及加速穩(wěn)定性。
　　結(jié)果：
　　1 臨床適用

14、性
　　926例病原學(xué)陽性血吸蟲病患者血清、100例非疫區(qū)健康人血清(Hp-S)合計1026例。其中陽性結(jié)果863例，試紙靈敏度為93.20％、特異度為93.00％、假陽性率為7.00％、假陰性率為6.80％、調(diào)整一致率為93.18％、約登指數(shù)為86.20％, kappa值為0.918。
　　2 等效性
　　926例病原學(xué)陽性血吸蟲病患者血清、100例Hp-S，合計1026例血清。分別應(yīng)用金標試紙及MPAIA試劑盒檢測

15、。兩種診斷試劑同為陽性781例，同為陰性85例。經(jīng)SPSS 18.0統(tǒng)計軟件及卡方檢驗:
　　3.1 kappa值為0.926。
　　3.2 x2=2.03，P>0.05，兩者差別無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3 穩(wěn)定性
　　3.1 長期穩(wěn)定性
　　試紙在室溫環(huán)境下保存0個月、4個月、8個月及12個月的靈敏度分別為96.11％、95.05％、91.34％、80.04％;特異度分別為93.00％、93.00％、95.0

16、0％、99.00％;一致率分別為95.65％、94.75％、91.89％、82.88％。
　　3.2 加速穩(wěn)定性
　　試紙在37℃溫箱環(huán)境下保存0天、1天、2天、4天、6天及7天的靈敏度分別為93.75％、89.06％、85.94％、75％、59.38％、53.13％;特異度分別為100.00％、100.00％、80.00％、80.00％、100.00％、100.00％;一致率分別為94.60％、90.54％、85.14％、

17、75.68％、64.87％、59.46％。
　　結(jié)論：
　　1.標準化日本血吸蟲病金標診斷試紙具有靈敏度高、特異度強等特點，其臨床適用性較好;
　　2.標準化日本血吸蟲病金標診斷試紙與病原學(xué)診斷及以上市同類試劑“日本血吸蟲病抗體檢測試劑盒(MPAIAI)”有高度等效性;
　　3.標準化日本血吸蟲病金標診斷試紙在室溫下保存，具有較高的穩(wěn)定性，高溫加速試驗對試紙穩(wěn)定性破壞較大，其保存應(yīng)注意溫度影響。
　　4.標