日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在蟲卵的免疫定位及其為捕獲抗原的金標(biāo)免疫滲濾法用于日本血吸蟲病快速診斷的研究.pdf

1、目的：探討日本血吸蟲26 kDa谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(SjGST)在蟲卵階段的表達(dá)、定位和以重組SjGST(rSjGST)為診斷抗原建立金標(biāo)免疫滲濾法(DIGFA)快速診斷日本血吸蟲感染的血清學(xué)檢測方法。 方法:從感染日本血吸蟲尾蚴42天的兔肝臟中分離蟲卵，分別用RT-PCR 和Western blotting 檢測SjGST基因在蟲卵階段的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；同時用兔肝組織做免疫組化，觀察SjGST在蟲卵內(nèi)的分布。采用檸檬酸三鈉還原法

2、制備15 n左右的膠體金，將葡萄球菌A蛋白(SPA)連接到膠體金上制備金標(biāo)-SPA，作為DIGFA抗原-抗體復(fù)合物的檢測試劑；從本室構(gòu)建的pET28a/SjGST/BL21菌種中誘導(dǎo)、表達(dá)并純化rSjGST，以rSjGST為抗原采用DIGFA(rSjGST-DIGFA)，對急、慢性日本血吸蟲病患者和正常人的血清進(jìn)行檢測，同時用日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)為抗原采用DIGFA(SEA-DIGFA)檢測上述血清，比較rSjGST-DI

3、GFA與SEA-DIGFA診斷日本血吸蟲病敏感性、特異性和實用性；再用rSjGST-ELISA和SEA-ELISA檢測上述血清，比較兩者之間敏感性和特異性；同時用rSjGST-DIGFA、SEA-DIGFA、rSjGST-ELISA和SEA-ELISA檢測華支睪吸蟲和鉤蟲感染者血清，比較不同抗原和不同方法診斷日本血吸蟲病的交叉反應(yīng)性。 結(jié)果：RT-PCR 從日本血吸蟲蟲卵中擴增出670 bp的基因片斷，Western blott

4、ing 顯示在成熟蟲卵階段SjGST的表達(dá)；免疫組化顯示SjGST主要分布在蟲卵內(nèi)毛蚴兩邊的側(cè)腺。從pET 28a/SjGST/BL 21菌種中大量誘導(dǎo)、表達(dá)并純化出rSjGST，SDS-PAGE檢測其分子量與理論值一致：以rSiGST為抗原采用DIGFA，經(jīng)過條件優(yōu)化，建立了rSjGST-DIGFA診斷日本血吸蟲病的方法。rSjGST-DIGFA用于檢測急、慢性日本血吸蟲病患者血清，與SEA-DIGFA比較，結(jié)果顯示：用兩種抗原檢測急

5、性患者血清102例，陽性率分別為93.1％和98.0％，敏感性無顯著性差異(p>0.05)；用兩種抗原檢測慢性患者血清207例，陽性率分別為80.7％和84.1％，敏感性也無顯著性差異(p>0.05)；兩種抗原對于140例正常對照者血清檢測的假陽性率分別為3.6％和1.4％，也無顯著性差異(p>0.05)。用rSsjGST-ELISA和SEA-ELISA檢測上述急性血清，陽性率分別為90.2％和99.0％，檢測上述慢性血清陽性率分別為8

6、2.1％和87.4％，檢測上述正常人血清，假陽性率分別為2.1％和2.1％，兩種方法對上述三種血清檢測的敏感性均無顯著性差異(p>0.05)。華支睪吸蟲和鉤蟲交叉反應(yīng)性分析結(jié)果：rSiGST-DIGFA和SEA-DIGFA比較，檢測華支睪吸蟲感染者血清的交叉反應(yīng)性分別為14.0％和8.0％，差異無顯著性(p>0.05)；檢測鉤蟲感染者血清的交叉反應(yīng)性分別為6.8％和4.1％，差異也無顯著性(p>0.05)。rSjGST-ELISA與SE