鉛暴露大鼠腦區(qū)鈣離子-鈣調(diào)素關(guān)聯(lián)信號(hào)通路及藥物調(diào)控研究.pdf

1、我國(guó)目前鉛污染程度非常嚴(yán)峻，鉛是一種重金屬元素，是目前最常見的工業(yè)及環(huán)境毒物，可在環(huán)境中長(zhǎng)期蓄積，對(duì)環(huán)境甚至食品造成污染，構(gòu)成對(duì)人類長(zhǎng)期的危害。鉛對(duì)人體卻沒有任何生理功能，鉛會(huì)通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)進(jìn)入腦神經(jīng)組織，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)不足發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。另外，兒童作為特殊群體，相比成人對(duì)鉛的神經(jīng)毒性更為敏感，已經(jīng)證實(shí)鉛具有很強(qiáng)的神經(jīng)發(fā)育毒性，鉛暴露的年齡越小，對(duì)鉛神經(jīng)毒性的易感性越高。鉛易透過

2、胎盤屏障及通過乳汁分泌，胎兒及嬰幼兒對(duì)鉛的神經(jīng)毒性更易敏感。鉛無(wú)安全臨界水平，鉛對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損害可發(fā)生在現(xiàn)有臨床血鉛濃度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)以下，并且兒童發(fā)育早期鉛暴露所產(chǎn)生的智力損害可持續(xù)到成年階段。目前，針對(duì)鉛暴露現(xiàn)臨床主要以預(yù)防為主，治療為輔，尚缺乏有效藥物能夠解決鉛神經(jīng)毒性的影響。
　　 為治療鉛引起的神經(jīng)毒性損傷，深入研究鉛神經(jīng)毒性分子機(jī)制是非常必要的。目前鉛神經(jīng)毒性分子機(jī)制研究中一個(gè)重要的內(nèi)容就是探討鉛對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centra

3、l nervous system，CNS)信號(hào)途徑傳導(dǎo)過程中鈣離子(calcium，Ca2+)和蛋白激酶功能的影響。鉛通過影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+正常流動(dòng)，干擾神經(jīng)細(xì)胞膜對(duì)Ca2+的攝取和釋放，擾亂細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)而發(fā)揮毒性作用。鉛也可取代Ca2+與鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)結(jié)合或直接與CaM結(jié)合，使之改變構(gòu)型，并可結(jié)合及激活其依賴性酶與載體在內(nèi)的調(diào)節(jié)蛋白，干擾神經(jīng)細(xì)胞的功能。但是Ca2+/CaM依存的信號(hào)途徑介導(dǎo)鉛神經(jīng)毒性的復(fù)

4、雜分子機(jī)制尚不完全清楚，因此進(jìn)一步深入研究鉛對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)Ca2+/CaM依賴性信號(hào)分子表達(dá)的影響對(duì)了解鉛介導(dǎo)神經(jīng)毒性分子機(jī)制具有重要意義。
　　 大量研究表明，鉛可誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，使細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，促使細(xì)胞和組織產(chǎn)生自由基，引起自由基生成增多，氧化損傷在鉛毒性機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。另外已經(jīng)了解到，當(dāng)組織細(xì)胞受到損傷或Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體(aut

5、olysosome)會(huì)激活，從而可以保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞內(nèi)毒物的損傷，但是過多的細(xì)胞自噬(autophagy)也會(huì)引起細(xì)胞過量損傷而發(fā)生程序性死亡。有報(bào)道鉛暴露會(huì)導(dǎo)致附睪上皮細(xì)胞自噬增加，但鉛暴露時(shí)是否會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬水平產(chǎn)生影響未見有研究報(bào)道，自噬溶酶體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與鉛神經(jīng)毒性過程尚不清楚。
　　 本研究通過建立大鼠急性鉛暴露模型，測(cè)定大鼠血鉛濃度和腦組織鉛含量，檢測(cè)腦海馬腹-背軸Ca2+/CaM依賴性信號(hào)分子的表達(dá)；建立大

6、鼠慢性鉛暴露模型及進(jìn)行藥物處理，檢測(cè)斷乳期仔鼠及藥物處理后子代大鼠的血鉛濃度和腦組織鉛含量，并檢測(cè)子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，然后檢測(cè)腦區(qū)Ca2+/CaM依賴性信號(hào)分子與自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，通過探討以期發(fā)現(xiàn)其中的內(nèi)在聯(lián)系，為鉛暴露神經(jīng)毒性分子機(jī)制研究及創(chuàng)新藥物治療靶點(diǎn)提供重要線索。對(duì)于慢性鉛暴露模型，我們使用具有清除自由基抗氧化作用的鈣調(diào)素抑制劑美拉托寧(melatonin)對(duì)子代大鼠進(jìn)行維期60天的調(diào)控干預(yù)，以期為臨床治療鉛神經(jīng)毒性提供相關(guān)

7、研究依據(jù)。
　　 第一章、急性鉛暴露大鼠海馬腹-背軸鈣離子/鈣調(diào)素依賴性信號(hào)分子表達(dá)研究
　　 目的：研究鉛暴露下腹側(cè)海馬與背側(cè)海馬是否存在不同的神經(jīng)生物化學(xué)改變。
　　 方法：建立大鼠急性鉛暴露模型，Sprague Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分成3組，2個(gè)鉛處理組(Low lead-exposed group、High lead-exposed group)每天分別腹腔注射25 mg/kg和50 mg/kg的

8、醋酸鉛，對(duì)照組(Control group)采用蒸餾水，持續(xù)5天。然后收集血樣與腦組織樣本，用石墨爐原子吸收分光光度法測(cè)定血鉛濃度與腦組織鉛含量，通過western blot法檢測(cè)背側(cè)海馬(doral hippocampus)和腹側(cè)海馬(ventral hippocampus)Ca2+/CaM依賴性蛋白的表達(dá)，包括鈣蛋白酶(calpain)的特殊底物血影蛋白(spectrin)，鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)，磷酸化鈣離子/鈣調(diào)蛋

9、白依賴性蛋白激酶Ⅱ(phosphorylation of calcium/calmodulin-dependent proteinkinaseⅡ，p-CaMKⅡ)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)。另外，通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了腹側(cè)海馬calcineurin的表達(dá)。
　　 結(jié)果：經(jīng)過5天的急性鉛暴露，血鉛濃度與腦組織鉛含量均顯著性升高(P<0.01)，其中海馬鉛含量高

10、于其它腦區(qū)鉛含量。我們?cè)诟箓?cè)海馬觀察到了calcineurin的結(jié)構(gòu)活性形式(45 kDa和48 kDa)，同時(shí)也觀察到了calpain激活引起spectrin降解的作用。我們的研究數(shù)據(jù)顯示，在急性鉛暴露后，nNOS在腹側(cè)海馬的表達(dá)顯著地高于背側(cè)海馬(P<0.05)，同時(shí)，相對(duì)于背側(cè)海馬而言，p-CaMKⅡ(Thr286)水平在腹側(cè)海馬表達(dá)顯著降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明急性鉛暴露會(huì)導(dǎo)致海馬腹-背軸Ca2+/

11、CaM依賴性信號(hào)分子呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。本章研究結(jié)果提示，相比背側(cè)海馬來(lái)說(shuō)，腹側(cè)海馬可能更易受到鉛神經(jīng)毒性的影響。
　　 第二章、慢性鉛暴露大鼠腦區(qū)鈣離子/鈣調(diào)素依賴性信號(hào)分子表達(dá)及藥物調(diào)控研究
　　 目的：深入探索慢性鉛暴露對(duì)大鼠腦區(qū)Ca2+/CaM依賴性信號(hào)分子表達(dá)及藥物調(diào)控研究。
　　 方法：首先建立仔鼠慢性鉛暴露模型，SD大鼠受孕后隨機(jī)分成4組，對(duì)照組(Control)給予蒸餾水，3個(gè)處理組(L-lead

12、、M-lead和H-lead)分別給予0.5 g/L、1.0 g/L和2.0 g/L的醋酸鉛飲用水。孕鼠自孕16天起自由飲用直至新生仔鼠21天斷乳為止，仔鼠由母鼠喂養(yǎng)至斷乳后與母鼠分籠飼養(yǎng)，并收集仔鼠血樣與腦組織樣以石墨爐原子吸收分光光度法進(jìn)行測(cè)定，剩余仔鼠開始飲用與其母鼠相同含量的醋酸鉛飲用水直至60天成熟期。然后基于仔鼠慢性鉛暴露模型，構(gòu)建5組慢性鉛暴露模型與藥物處理組，4個(gè)處理組(L-lead或L、L-lead+Melatonin

13、或L+M、H-lead或H、H-lead+Melatonin或H+M)繼續(xù)飲用原相同含量的醋酸鉛飲用水，L+M組和H+M組每天灌胃美拉托寧溶液，劑量為5 mg/kg，對(duì)照組(Control或C)繼續(xù)給予蒸餾水，持續(xù)60天。以Morris水迷宮觀測(cè)子代大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，并收集血樣與腦組織樣以石墨爐原子吸收分光光度法進(jìn)行測(cè)定。用westernblot法檢測(cè)腦區(qū)Ca2+/CaM依賴性蛋’白的表達(dá)，包括CaMKⅡ途徑和蛋白激酶C(prot

14、ein kinase C，PKC)途徑關(guān)聯(lián)蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：仔鼠慢性鉛暴露模型中，21天鉛暴露仔鼠血鉛濃度與腦組織鉛含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。慢性鉛暴露模型與藥物處理后，Morris水迷宮測(cè)定結(jié)果顯示鉛暴露組逃避潛伏期(escape latency)、目標(biāo)象限停留時(shí)間(time in correctquadrant)及過臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，藥物處理組與鉛暴露組相比亦無(wú)顯著性差異；與同一天的對(duì)照組相比，

15、第1天低劑量鉛暴露組與對(duì)應(yīng)的美拉托寧處理組、第2天低劑量鉛暴露美拉托寧處理組短期記憶時(shí)間(short-term memory)顯著增多(P<0.01)，各天美拉托寧處理組與對(duì)應(yīng)的鉛暴露組相比無(wú)顯著性差異。鉛暴露組血鉛、海馬鉛、皮層鉛與紋狀體鉛含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，美拉托寧處理組血鉛濃度、腦組織鉛含量與對(duì)應(yīng)的鉛暴露組相比無(wú)顯著性差異。隨著鉛暴露劑量的升高，我們觀察到海馬CaMKⅡ(Thr286位點(diǎn))磷酸化活性減弱而p-Sy

16、napsinⅠ(Ser603)和p-GluR1(Ser831)水平表達(dá)代償性升高，此外，慢性鉛暴露后海馬p-ERK(Thr202/Tyr204)表達(dá)上調(diào)，海馬PKC途徑中NMDAR1表達(dá)增加，p-MARCKS(Ser152/156)表達(dá)減少，高劑量慢性鉛暴露組海馬p-NR1(Ser896)與MARCKS表達(dá)增加。美拉托寧處理后對(duì)高劑量慢性鉛暴露海馬p-GluR1(Ser831)、p-ERK(Thr202/Tyr204)、NMDAR1、p

17、-MARCKS(Ser152/156)與MARCKS有一定的逆轉(zhuǎn)調(diào)控作用。此外，慢性鉛暴露組紋狀體CaMKⅡ途徑和PKC途徑關(guān)聯(lián)蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組無(wú)顯著的變化。
　　 結(jié)論：本章研究結(jié)果表明慢性鉛暴露對(duì)大鼠短期學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生了影響，海馬Ca2+/CaM依賴性信號(hào)分子系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)失衡參與了鉛神經(jīng)毒性分子機(jī)制過程，本研究的實(shí)驗(yàn)周期及治療療程條件下，美拉托寧對(duì)高劑量慢性鉛暴露大鼠海馬p-GluR1(Ser831)、p-ERK(Thr20

18、2/Tyr204)、NMDAR1、p-MARCKS(Ser152/156)與MARCKS有一定的逆轉(zhuǎn)調(diào)控作用。
　　 第三章、慢性鉛暴露大鼠腦區(qū)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及藥物調(diào)控研究
　　 目的：探索自噬溶酶體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與介導(dǎo)鉛神經(jīng)毒性分子機(jī)制過程及藥物調(diào)控研究。
　　 方法：以第二章慢性鉛暴露模型與藥物處理所收集腦組織為研究對(duì)象，用western blot法檢測(cè)海馬與皮層自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，具體包括Beclin

19、1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)、核孔蛋白(nucleoporin，p62)、溶酶體相關(guān)膜蛋白2(lysosomal-associated membrane protein2，LAMP2)、組織蛋白酶B(cathepsin B)。
　　 結(jié)果：經(jīng)過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于各自的對(duì)照組來(lái)說(shuō)，在腦海馬神經(jīng)細(xì)胞低劑量鉛暴露組Beclin1表達(dá)明顯下調(diào)(

20、P<0.05)；高劑量鉛暴露組Beclin1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，LC3有極顯著上調(diào)(P<0.001)，cathepsin B在38 kDa處有明顯下調(diào)(P<0.001)，30 kDa與25 kDa處片段有下調(diào)趨勢(shì)，但無(wú)顯著性的差異。在腦皮層神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)低劑量鉛暴露組p62表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；高劑量鉛暴露組LC3、p62與LAMP2表達(dá)均有顯著增加(P<0.05)。美拉托寧處理組與對(duì)應(yīng)的鉛暴露相比，各個(gè)自噬相關(guān)蛋白表