新型肝癌免疫毒素的構(gòu)建表達與活性鑒定.pdf

1、原發(fā)性肝癌在世界范圍分布較廣泛，是嚴重影響我國人民健康的疾病之一。隨著現(xiàn)代醫(yī)學影像技術(shù)的發(fā)展，肝癌的診斷率和準確性大幅度地提高了，但是包括基因工程技術(shù)在內(nèi)的現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展在肝癌臨床治療中的應用和對預后的提高上幾乎是微乎其微，傳統(tǒng)的腫瘤治療方法在肝癌的治療中仍占據(jù)絕對主導地位。隨著肝臟外科技術(shù)的改進，肝癌的手術(shù)切除率和治療效果也不斷提高，手術(shù)死亡率隨之降低，但手術(shù)治療也有其特有的局限性，尤其在肝癌的中晚期病人中，往往已不能采取手

2、術(shù)治療的方法。另外常規(guī)的放射治療和化學治療等方法也存在種種不足和缺陷，如腫瘤的耐藥性以及嚴重的副作用。因此研究肝癌的診斷與治療新方法具有十分重要的理論與現(xiàn)實意義。 免疫毒素是近年來新興的一種腫瘤導向治療方法。它利用抗腫瘤單抗與腫瘤細胞的特異性結(jié)合，將生物毒素與抗體偶聯(lián)，定向攻擊腫瘤細胞，而對正常組織的殺傷較小，故被形象地稱為“生物導彈”。免疫毒素的細胞毒作用主要源于各種生物毒素，它們的生物活性較高、毒性較大。我們采用的毒素是改造

3、過的綠膿桿菌外毒素PE40KDEL，即去除原毒素中的細胞非特異性結(jié)合域并進行了氨基酸突變以增加其細胞毒性，使獲得的毒素蛋白在喪失了非特異性細胞毒性的同時增加了對靶細胞的毒性，因而具有很高的應用價值。目前，免疫毒素已在乳腺癌、黑色素瘤、白血病治療和體外骨髓移植等方面獲得了一定的進展，有不少制劑也進入臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗階段。但由抗體介導的免疫毒素在體內(nèi)的應用還沒有人們預期的那么有效，其原因主要在于：一，鼠源性抗體進入人后會產(chǎn)生人抗鼠的抗體(H

4、AMA)，引起人體過敏反應；二，抗體分子量大，在體內(nèi)組織的穿透能力差；三，目前多數(shù)的小分子抗體自身的親和力較低，特異性不高；四，腫瘤自身抗原表達的不均一性及抗原的調(diào)變，可以逃避偶聯(lián)藥物與之的結(jié)合，從而影響治療效果。隨著小分子多肽研究的進一步深入，尤其是隨著噬菌體肽庫技術(shù)的發(fā)展，小分子導向載體的發(fā)現(xiàn)和應用為導向治療提供了新途徑。 本課題擬從噬菌體展示肽庫中篩選能與肝癌細胞發(fā)生特異性結(jié)合的噬菌體肽(稱為肝癌特異性結(jié)合肽，liverc

5、anceradhesionpeptide，LAP)，并與改造過的綠膿桿菌外毒素PE40KDEL進行基因重組，旨在得到特異性高，殺傷力強的新型免疫毒素。該免疫毒素與目前以抗體為導向的免疫毒素相比，具有分子量較小、免疫原性相對較低、特異性高等優(yōu)點，理論上可以有效提高定向傳遞治療藥物的能力。而噬菌體肽庫技術(shù)用于篩選組織特異性結(jié)合肽，其最大優(yōu)點就是無需知道蛋白質(zhì)的任何性質(zhì)，就可篩選得到特異性的結(jié)合肽。本文采用的體內(nèi)篩選方法，可以最大限度地維持肝

6、癌細胞在體內(nèi)的自然狀態(tài)，另外噬菌體肽庫進入動物體內(nèi)循環(huán)，通過各種正常組織的吸收可以盡量去除非特異性結(jié)合的噬菌體肽，起到了理想的反向吸收作用。同時腫瘤組織中特殊的構(gòu)成結(jié)構(gòu)也為篩選提供了更為豐富的靶目標。特異性結(jié)合肽分子量小，免疫原性低，具有很好的生物相容性，具有替代單克隆抗體的潛力，有望在腫瘤的靶向治療領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。 采用基因工程技術(shù)，利用噬菌體展示技術(shù)篩選到的肝癌特異性結(jié)合肽A54，A22，B3，C1(根據(jù)特異性結(jié)合系數(shù)的

7、大小為選擇依據(jù)，C1作為陰性對照)與PE40KDEL進行基因重組，構(gòu)建了兩種形式的免疫毒素原核表達載體；并探討了這些載體在大腸桿菌中誘導表達的形式及表達條件；通過幾種純化方法得到了免疫毒素，并初步研究了這些免疫毒素對人肝癌細胞株BEL-7402，BEL-7404，SMMC-7721的生長抑制作用。制備出了特異性的新型肝癌免疫毒素，為今后肝癌的臨床導向治療研究打下基礎(chǔ)。實驗方法和結(jié)果如下： 本課題構(gòu)建了兩種形式的免疫毒素原核表達載

8、體。第一種形式是為了最大限度地保持結(jié)合肽在原噬菌體上原有的天然構(gòu)像和功能，在采用PCR方法擴增肝癌特異性結(jié)合肽A54，A22，B3，C1基因片段的同時，保留了噬菌體P3蛋白上與多肽連接的部分序列。并在基因兩端加上所需的酶切位點與基因PE40KDEL連接，構(gòu)建原核表達載體LAP(P3)-PE40KDEL-pLY5。第二種形成是通過化學合成的方法合成了A54基因，構(gòu)建了A54-PE40KDEL-pET32a(+)表達載體，以獲得可溶性表達的

9、免疫毒素。這兩種形式構(gòu)建的免疫毒素原核表達載體，通過基因測序證實無突變，pLY5表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，溫度誘導后，成功表達了預期的融合蛋白，分子量為55kD，且最大表達量達到細菌總蛋白的18～24％，表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，經(jīng)變性，復性，重折疊，初步純化后得到LAP(P3)-PE40KDEL肝癌免疫毒素。pET32a(+)表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21，受IPTG誘導之后，成功表達了預期的硫氧還蛋白融合蛋白，分子量為58

10、kD，最大表達量占細菌總蛋白的12～15％，表達產(chǎn)物主要以可溶形式存在。融合蛋白經(jīng)金屬鎳離子螯合親和層析純化，腸激酶酶切，進一步純化后得到A54-PE40KDEL肝癌免疫毒素，分子量為41kD，純度達到實驗要求。 為進一步研究肝癌免疫毒素的活性，了解其對人肝癌細胞株BEL-7402、SMMC-7721、BEL-7404，人結(jié)腸癌細胞HCT-8及RKO，人黑色素瘤細胞A375，正常人肝細胞HL-7702等的生長抑制作用。本課題采用

11、MTT法測定了不同濃度下免疫毒素對以上細胞的作用效果。實驗結(jié)果顯示：(1)A54(P3)-PE40KDEL、A22(P3)-PE40KDEL、B3(P3)-PE40KDEL對BEL-7404有明顯的殺傷作用，在統(tǒng)計學上有顯著意義，其中A54(P3)-PE40KDEL的殺傷作用最強(IC50=33.5μg/ml)，B3(P3)-PE40KDEL其次(IC50=41.0μg/ml)，A22(P3)-PE40KDEL第三(IC50=56.2μ

12、g/ml)，較上述免疫毒素而言，C1(P3)-PE40KDE對BEL-7404無明顯殺傷作用(IC50＞100μg/ml)；(2)B3(P3)-PE40KDEL對多種細胞毒性顯示，其對人肝癌細胞株BEL-7402、SMMC-7721、BEL-7404殺傷作用明顯，同樣濃度的免疫毒素對人結(jié)腸癌細胞HCT-8及RKO，人黑色素瘤細胞A375的殺傷作用相對較弱，細胞毒性具有統(tǒng)計學顯著意義；(3)A54-PE40KDEL對以上幾種細胞的毒性作用

13、呈現(xiàn)與B3(P3)-PE40KDEL的毒性作用相近的趨勢；(4)A54(P3)-PE40KDEL與A54-PE40KDEL對BEL-7402的IC50分別為25.51μg/ml和18.95μg/ml，兩者的細胞毒活性在統(tǒng)計學上有顯著意義；(5)以上各免疫毒素對正常肝細胞HL-7702具明顯殺傷，該殺傷性不因?qū)蚍肿硬町惗煌?實驗研究結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了肝癌特異性結(jié)合肽融合改構(gòu)型綠膿桿菌外毒素PE40KDEL的表達載體；(2