新型肝癌免疫毒素的構(gòu)建表達(dá)與活性鑒定.pdf

1、原發(fā)性肝癌在世界范圍分布較廣泛，是嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康的疾病之一。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的發(fā)展，肝癌的診斷率和準(zhǔn)確性大幅度地提高了，但是包括基因工程技術(shù)在內(nèi)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展在肝癌臨床治療中的應(yīng)用和對(duì)預(yù)后的提高上幾乎是微乎其微，傳統(tǒng)的腫瘤治療方法在肝癌的治療中仍占據(jù)絕對(duì)主導(dǎo)地位。隨著肝臟外科技術(shù)的改進(jìn)，肝癌的手術(shù)切除率和治療效果也不斷提高，手術(shù)死亡率隨之降低，但手術(shù)治療也有其特有的局限性，尤其在肝癌的中晚期病人中，往往已不能采取手

2、術(shù)治療的方法。另外常規(guī)的放射治療和化學(xué)治療等方法也存在種種不足和缺陷，如腫瘤的耐藥性以及嚴(yán)重的副作用。因此研究肝癌的診斷與治療新方法具有十分重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。 免疫毒素是近年來(lái)新興的一種腫瘤導(dǎo)向治療方法。它利用抗腫瘤單抗與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合，將生物毒素與抗體偶聯(lián)，定向攻擊腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常組織的殺傷較小，故被形象地稱為“生物導(dǎo)彈”。免疫毒素的細(xì)胞毒作用主要源于各種生物毒素，它們的生物活性較高、毒性較大。我們采用的毒素是改造

3、過(guò)的綠膿桿菌外毒素PE40KDEL，即去除原毒素中的細(xì)胞非特異性結(jié)合域并進(jìn)行了氨基酸突變以增加其細(xì)胞毒性，使獲得的毒素蛋白在喪失了非特異性細(xì)胞毒性的同時(shí)增加了對(duì)靶細(xì)胞的毒性，因而具有很高的應(yīng)用價(jià)值。目前，免疫毒素已在乳腺癌、黑色素瘤、白血病治療和體外骨髓移植等方面獲得了一定的進(jìn)展，有不少制劑也進(jìn)入臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)階段。但由抗體介導(dǎo)的免疫毒素在體內(nèi)的應(yīng)用還沒(méi)有人們預(yù)期的那么有效，其原因主要在于：一，鼠源性抗體進(jìn)入人后會(huì)產(chǎn)生人抗鼠的抗體(H

4、AMA)，引起人體過(guò)敏反應(yīng)；二，抗體分子量大，在體內(nèi)組織的穿透能力差；三，目前多數(shù)的小分子抗體自身的親和力較低，特異性不高；四，腫瘤自身抗原表達(dá)的不均一性及抗原的調(diào)變，可以逃避偶聯(lián)藥物與之的結(jié)合，從而影響治療效果。隨著小分子多肽研究的進(jìn)一步深入，尤其是隨著噬菌體肽庫(kù)技術(shù)的發(fā)展，小分子導(dǎo)向載體的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為導(dǎo)向治療提供了新途徑。 本課題擬從噬菌體展示肽庫(kù)中篩選能與肝癌細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的噬菌體肽(稱為肝癌特異性結(jié)合肽，liverc

5、anceradhesionpeptide，LAP)，并與改造過(guò)的綠膿桿菌外毒素PE40KDEL進(jìn)行基因重組，旨在得到特異性高，殺傷力強(qiáng)的新型免疫毒素。該免疫毒素與目前以抗體為導(dǎo)向的免疫毒素相比，具有分子量較小、免疫原性相對(duì)較低、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，理論上可以有效提高定向傳遞治療藥物的能力。而噬菌體肽庫(kù)技術(shù)用于篩選組織特異性結(jié)合肽，其最大優(yōu)點(diǎn)就是無(wú)需知道蛋白質(zhì)的任何性質(zhì)，就可篩選得到特異性的結(jié)合肽。本文采用的體內(nèi)篩選方法，可以最大限度地維持肝

6、癌細(xì)胞在體內(nèi)的自然狀態(tài)，另外噬菌體肽庫(kù)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)循環(huán)，通過(guò)各種正常組織的吸收可以盡量去除非特異性結(jié)合的噬菌體肽，起到了理想的反向吸收作用。同時(shí)腫瘤組織中特殊的構(gòu)成結(jié)構(gòu)也為篩選提供了更為豐富的靶目標(biāo)。特異性結(jié)合肽分子量小，免疫原性低，具有很好的生物相容性，具有替代單克隆抗體的潛力，有望在腫瘤的靶向治療領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。 采用基因工程技術(shù)，利用噬菌體展示技術(shù)篩選到的肝癌特異性結(jié)合肽A54，A22，B3，C1(根據(jù)特異性結(jié)合系數(shù)的

7、大小為選擇依據(jù)，C1作為陰性對(duì)照)與PE40KDEL進(jìn)行基因重組，構(gòu)建了兩種形式的免疫毒素原核表達(dá)載體；并探討了這些載體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的形式及表達(dá)條件；通過(guò)幾種純化方法得到了免疫毒素，并初步研究了這些免疫毒素對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402，BEL-7404，SMMC-7721的生長(zhǎng)抑制作用。制備出了特異性的新型肝癌免疫毒素，為今后肝癌的臨床導(dǎo)向治療研究打下基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下： 本課題構(gòu)建了兩種形式的免疫毒素原核表達(dá)載

8、體。第一種形式是為了最大限度地保持結(jié)合肽在原噬菌體上原有的天然構(gòu)像和功能，在采用PCR方法擴(kuò)增肝癌特異性結(jié)合肽A54，A22，B3，C1基因片段的同時(shí)，保留了噬菌體P3蛋白上與多肽連接的部分序列。并在基因兩端加上所需的酶切位點(diǎn)與基因PE40KDEL連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體LAP(P3)-PE40KDEL-pLY5。第二種形成是通過(guò)化學(xué)合成的方法合成了A54基因，構(gòu)建了A54-PE40KDEL-pET32a(+)表達(dá)載體，以獲得可溶性表達(dá)的

9、免疫毒素。這兩種形式構(gòu)建的免疫毒素原核表達(dá)載體，通過(guò)基因測(cè)序證實(shí)無(wú)突變，pLY5表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，溫度誘導(dǎo)后，成功表達(dá)了預(yù)期的融合蛋白，分子量為55kD，且最大表達(dá)量達(dá)到細(xì)菌總蛋白的18～24％，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，經(jīng)變性，復(fù)性，重折疊，初步純化后得到LAP(P3)-PE40KDEL肝癌免疫毒素。pET32a(+)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，受IPTG誘導(dǎo)之后，成功表達(dá)了預(yù)期的硫氧還蛋白融合蛋白，分子量為58

10、kD，最大表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的12～15％，表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶形式存在。融合蛋白經(jīng)金屬鎳離子螯合親和層析純化，腸激酶酶切，進(jìn)一步純化后得到A54-PE40KDEL肝癌免疫毒素，分子量為41kD，純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。 為進(jìn)一步研究肝癌免疫毒素的活性，了解其對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、SMMC-7721、BEL-7404，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8及RKO，人黑色素瘤細(xì)胞A375，正常人肝細(xì)胞HL-7702等的生長(zhǎng)抑制作用。本課題采用

11、MTT法測(cè)定了不同濃度下免疫毒素對(duì)以上細(xì)胞的作用效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)A54(P3)-PE40KDEL、A22(P3)-PE40KDEL、B3(P3)-PE40KDEL對(duì)BEL-7404有明顯的殺傷作用，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義，其中A54(P3)-PE40KDEL的殺傷作用最強(qiáng)(IC50=33.5μg/ml)，B3(P3)-PE40KDEL其次(IC50=41.0μg/ml)，A22(P3)-PE40KDEL第三(IC50=56.2μ

12、g/ml)，較上述免疫毒素而言，C1(P3)-PE40KDE對(duì)BEL-7404無(wú)明顯殺傷作用(IC50＞100μg/ml)；(2)B3(P3)-PE40KDEL對(duì)多種細(xì)胞毒性顯示，其對(duì)人肝癌細(xì)胞株BEL-7402、SMMC-7721、BEL-7404殺傷作用明顯，同樣濃度的免疫毒素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8及RKO，人黑色素瘤細(xì)胞A375的殺傷作用相對(duì)較弱，細(xì)胞毒性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義；(3)A54-PE40KDEL對(duì)以上幾種細(xì)胞的毒性作用

13、呈現(xiàn)與B3(P3)-PE40KDEL的毒性作用相近的趨勢(shì)；(4)A54(P3)-PE40KDEL與A54-PE40KDEL對(duì)BEL-7402的IC50分別為25.51μg/ml和18.95μg/ml，兩者的細(xì)胞毒活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義；(5)以上各免疫毒素對(duì)正常肝細(xì)胞HL-7702具明顯殺傷，該殺傷性不因?qū)蚍肿硬町惗煌?實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了肝癌特異性結(jié)合肽融合改構(gòu)型綠膿桿菌外毒素PE40KDEL的表達(dá)載體；(2