胱抑素C高表達(dá)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠左室重塑的影響.pdf

1、目的：半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白即胱抑素C(Cystatin C，Cys C)，其血清濃度測(cè)定是替代傳統(tǒng)的血尿素和肌酐(Cr)測(cè)定的首選腎功能評(píng)價(jià)指標(biāo)。近年來，數(shù)據(jù)顯示CysC是心臟病終點(diǎn)事件（發(fā)病率、死亡率、心衰等）的早期危險(xiǎn)標(biāo)志物，與左室重塑及心功能障礙有高度相關(guān)性，尤其在老年人群及高血壓病人群。基于鹽敏感大鼠的試驗(yàn)結(jié)果顯示在心肌肥厚期CysC及Cats的mRNA及蛋白表達(dá)均升高。心衰期Cats表達(dá)繼續(xù)升高，而CysC的表達(dá)降低或相對(duì)降

2、低。以上數(shù)據(jù)顯示CysC不僅是慢性心衰的標(biāo)志物，而且可能在高血壓病左室重塑中有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的CysC基因在SHR大鼠心肌中過表達(dá)，探索CysC與Cat K在SHR大鼠心肌的表達(dá)對(duì)左室重塑和心功能的影響。
　　 方法：
　　 l、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和設(shè)計(jì)
　　 選擇32周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)63只，隨機(jī)分為CysC腺病毒轉(zhuǎn)染高表達(dá)組、空載體對(duì)照組、空白對(duì)照組。同齡Wistar大鼠21只作陰性參照

3、。分批于腺病毒轉(zhuǎn)染前O天，注射后2天及4周處死大鼠。測(cè)量鼠尾動(dòng)脈血壓，稱體重、左室質(zhì)量，計(jì)算左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI=左室重量/體重)。留取心尖（約1/2左心室）錫箔紙包裹后液氮冷凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆糜趒RT-PCR。余1/2左室組織經(jīng)4％中性多聚甲醛液固定48小時(shí)后石蠟包埋備用于免疫組織化學(xué)染色。
　　 2、病毒轉(zhuǎn)染
　　 大鼠麻醉后，剃除胸部毛發(fā)，PHILIPS公司IE33超聲儀，S12-5超聲探頭引導(dǎo)，取左室短軸

4、心底及心尖切面，應(yīng)用26G針頭分別于左室前壁及側(cè)壁共注射5.36×lOl0pfu/ml的Ad-CC或Ad-GFPIOOul，對(duì)照組注射等量PBS。
　　 3、超聲心動(dòng)圖測(cè)量
　　 PHILIPS公司IE33心臟超聲儀，選S12-5超聲探頭，頻率5MHz，測(cè)量左室乳頭肌水平左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)以評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)及功能。
　　 4、實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(qR

5、T-PCR)
　　 Trizol法提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄mRNA至cDNA，經(jīng)Primer5.0設(shè)計(jì)CysC特異引物，B-actin為內(nèi)參照，熒光定量PCR檢測(cè)CysC的mRNA相對(duì)表達(dá)。
　　 5、免疫組織化學(xué)染色
　　 取組織切片，進(jìn)行CysC及CatK免疫組織化學(xué)染色，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取5張切片，隨機(jī)分析3個(gè)視野，圖像采用IPP6.0軟件分析，取其平均累積光密度(IOD)，半定量分析蛋白表達(dá)。
　　

6、 6、Masson染色
　　 切片常規(guī)脫蠟至蒸餾水，Masson復(fù)合染液及亮綠染液染色，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡觀察，并采集圖像。IPP6.0軟件分析，選取3個(gè)無血管視野測(cè)定膠原纖維在每個(gè)視野中所占比率，最后取均數(shù)代表總膠原容積評(píng)分(CVF)=膠原面積/總面積。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各項(xiàng)觀察指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，單因素方差分析。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P

7、示有差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、實(shí)驗(yàn)過程中3只SHR大鼠死亡，高表達(dá)組2只，空載體組1只，最終60只完成實(shí)驗(yàn)。其中高表達(dá)組19只，空載體組20只，對(duì)照組21只。
　　 2、與對(duì)照組比較，CysC在高表達(dá)組轉(zhuǎn)染后2天表達(dá)最高(P

8、W組降低(P<0.05)。
　　 3、CysC高表達(dá)組大鼠LVMI、LVEDD及LVFS較對(duì)照組有差異(P<0.05)。CVF也增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=O.076)?？蛰d體組較對(duì)照組無差別。與W組比較，SHR各組大鼠LVMI、LVEDD及LVFS均有明顯差異(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、超聲引導(dǎo)心肌局部注射成功實(shí)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的CysC心肌局部高表達(dá)，減少實(shí)驗(yàn)大鼠的死亡率。2、慢性心衰期SHR大鼠心