雌激素及其受體人永生化表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染人乳頭狀瘤病毒E6基因的影響.pdf

1、目的:
　　 人乳頭狀瘤病毒(HPV)是宮頸癌、頭頸部皮膚癌、食道癌等癌癥的致病因素。隨著口服避孕藥的廣泛應(yīng)用以及雌激素替代療法的使用，雌激素是否會增加雌激素使用者感染HPV的風(fēng)險目前尚無定論。本實(shí)驗(yàn)研究了雌二醇對人永生化表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染人乳頭狀瘤病毒16型E6基因的影響和機(jī)制，探討外源性雌激素的使用是否增加人乳頭狀瘤病毒感染的風(fēng)險。
　　 方法:
　　 單層培養(yǎng)的人永生化表皮細(xì)胞系(HaCat)以不同濃度的17-β

2、-雌二醇(E2)及4-羥基三苯氧胺（4-OHT）處理后，以脂質(zhì)體-2000作為載體將含人乳頭狀瘤病毒16型E6基因的質(zhì)粒對HaCat細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后以熒光相對定量PCR法測定細(xì)胞中HPV16型E6基因的表達(dá)。在不同的時間點(diǎn)以細(xì)胞計數(shù)法繪制HaCat細(xì)胞生長曲線，以MTT法測定HaCat細(xì)胞活性。流式細(xì)胞儀檢測HaCat細(xì)胞凋亡情況與細(xì)胞周期分布。BrdU法測定HaCat細(xì)胞周期的時相。Western Blot法測定雌激素受體α和β兩

3、種亞型蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞計數(shù)法繪制的生長曲線顯示，濃度為10-5-10-7mol/L的E2促進(jìn)HaCat細(xì)胞生長。濃度為10-8-10-9mol/L的E2對HaCat細(xì)胞的生長無明顯的促進(jìn)作用。濃度為10-5-10-7mol/L的4-OHT對HaCat細(xì)胞的生長無明顯的影響。
　　 2.MTT法結(jié)果顯示濃度為10-6-10-8mol/L的E2明顯增強(qiáng)HaCat細(xì)胞活性。而濃度為10-5

4、與10-9mol/L的E2與濃度為10-5-10-7mol/L的4-OHT對HaCat細(xì)胞的活性無明顯影響。
　　 3.流式細(xì)胞儀的結(jié)果顯示經(jīng)E2處理的HaCat細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡比率增加，并具有濃度依賴性。同時4OHT處理的HaCat細(xì)胞的凋亡率也有輕微增加，但未見明顯的濃度相關(guān)性。這兩種藥物都不影響該細(xì)胞系細(xì)胞周期的各階段的分布。
　　 4.BrdU法結(jié)果顯示，E2使HaCat細(xì)胞的細(xì)胞周期時相縮短，高濃度4-OHT可將

5、細(xì)胞周期的時間延長，但其余濃度則對此并無影響。
　　 5.Western blot結(jié)果顯示E2處理的HaCat細(xì)胞雌激素受體-β的表達(dá)增加，具有濃度依賴趨勢;雌激素受體-α的表達(dá)與E2的濃度無明顯相關(guān)。4-OHT作用后兩種雌激素受體的亞型均沒有檢測到。
　　 6.熒光相對定量-PCR顯示經(jīng)過E2處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)染人乳頭狀瘤病毒16型E6基因后，隨著E2濃度的增加，人乳頭狀瘤病毒16型E6基因的mRNA表達(dá)明顯增加。4-OHT

6、作用后人乳頭狀瘤病毒16型E6基因mRNA表達(dá)減少，但各濃度之間無明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.E2增加人乳頭狀瘤病毒16型E6基因轉(zhuǎn)染HaCat細(xì)胞的效率。其機(jī)制可能與E2通過雌激素受體加速宿主細(xì)胞生長及增殖有關(guān);
　　 2.E2增加HaCat細(xì)胞ER-β蛋白水平的表達(dá);ER-β在E2影響人乳頭狀瘤病毒16型E6基因轉(zhuǎn)染的過程中可能存在關(guān)鍵性的作用;
　　 3.雌激素受體拮抗劑可能降低人乳頭狀瘤病