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1、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞處于光感受器外節(jié)和脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞之間。最為突出的功能是吞噬和消化老化脫落的外節(jié)膜盤,隨著年齡的增長(zhǎng)RPE細(xì)胞內(nèi)的脂褐素會(huì)逐漸積累,這也成為其衰老的標(biāo)志之一。在可見光或紫外線誘導(dǎo)下積累的脂褐素產(chǎn)生活性氧并引起 RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及未折疊蛋白反應(yīng)等,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,引發(fā)年齡相關(guān)性眼病。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白分子伴侶,有輔助蛋白質(zhì)正確折疊的功能,同時(shí)參與到細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中。
本文的研究對(duì)象為紅
2、葡萄皮提取物。通過化學(xué)合成脂褐素主要熒光物質(zhì) A2E(N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺),建立 RPE細(xì)胞累積脂褐素模型。檢測(cè)藍(lán)光誘導(dǎo)A2E累積RPE細(xì)胞凋亡,進(jìn)而研究GSEs對(duì)凋亡的抑制作用。在此基礎(chǔ)上,研究了GSEs對(duì)A2E累積RPE細(xì)胞中GRP78及其下游凋亡信號(hào)分子CHOP表達(dá)的影響。此外,初步探討了GSEs對(duì)A2E累積RPE細(xì)胞中活性氧(ROS)的抑制作用。為GSEs作為一種膳食補(bǔ)充劑降低年齡相關(guān)性眼病風(fēng)險(xiǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題
3、的主要研究結(jié)果如下:
?。?)通過化學(xué)方法合成并純化獲得實(shí)驗(yàn)所需A2E,建立RPE細(xì)胞脂褐素積累模型。當(dāng)A2E處理濃度為25μM時(shí),A2E積累量為141±7 ng/10^5個(gè)細(xì)胞與老年人眼組織RPE細(xì)胞中含量相近。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)A2E分散在細(xì)胞核周圍,與人眼組織中RPE細(xì)胞生理狀態(tài)一致。
?。?)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。低濃度A2E對(duì)RPE細(xì)胞活力沒有影響,25μM A2E處理RPE細(xì)胞經(jīng)藍(lán)光照射后培養(yǎng)12h抑制
4、率到達(dá)17.87±2.91%。GSEs能抑制藍(lán)光誘導(dǎo)A2E累積RPE細(xì)胞活性下降。
?。?)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。25μM A2E處理RPE細(xì)胞后出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,且呈現(xiàn)出時(shí)間效應(yīng)。GSEs能抑制藍(lán)光誘導(dǎo) A2E累積RPE細(xì)胞凋亡,濃度為5μg/mL時(shí)抑制作用最為顯著。
?。?)機(jī)理研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GSEs通過上調(diào)GRP78表達(dá)抑制藍(lán)光誘導(dǎo)A2E累積RPE細(xì)胞凋亡。同時(shí),GSEs能抑制GRP78下游凋亡信號(hào)分子CHOP
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