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文檔簡介
1、目的:葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78),又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP),是熱休克蛋白70(HSP70)家族的重要成員。GRP78最初被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中作為分子伴侶,對蛋白質(zhì)的正確折疊組裝起著重要作用,而在腫瘤細(xì)胞中GRP78可以被誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡以及增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。近來發(fā)現(xiàn)GRP78不僅存在于細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,也可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜甚至可以分泌到細(xì)胞外,而分泌型GRP78作為腫瘤微環(huán)境的組成部分對腫
2、瘤的作用還不完全清楚。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ),GRP78對免疫細(xì)胞特別對樹突狀細(xì)胞的生長分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究探討腫瘤細(xì)胞分泌的GRP78作為腫瘤微環(huán)境的組成部分,對腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的影響。
方法:⑴利用PMA可以促進(jìn)單核細(xì)胞THP1向巨噬細(xì)胞分化這一研究模型,研究GRP78對巨噬細(xì)胞極化的影響。提取純化原核表達(dá)蛋白GRP78與丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)共同刺激單核細(xì)胞THP1,并分組設(shè)立GRP78濃度梯度10
3、ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml,刺激72h后收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD163、FGL2。用Trizol提取細(xì)胞的RNA,利用RT-PCR方法檢測FIZZ1、IL10、TGFβ、ARG1和iNOS等分子的RNA表達(dá)。⑵設(shè)計(jì)與GRP78編碼序列互補(bǔ)的引物對,引入Xho I和Hind III酶切位點(diǎn),取實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的人來源GRP78原核表達(dá)載體pGEX-4T-3-GRP78為模板,PCR擴(kuò)增人GRP
4、78基因(去內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號中的KDEL序列);將GRP78基因片段及PET42a空載質(zhì)粒均用Xho I和Hind III酶切處理后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,回收帶有相同黏性末端的片段用T4連接酶進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌,并挑取陽性菌落擴(kuò)增提取質(zhì)粒酶切鑒定,將酶切正確的質(zhì)粒送公司測序,保留測序正確的質(zhì)粒pET-42a-GRP78及菌種。同理,設(shè)計(jì)與GRP78編碼序列互補(bǔ)的引物對,引入6個His標(biāo)簽及Pst I和BamH I酶切位點(diǎn)
5、,以前述pET42a-GRP78載體為模板,擴(kuò)增目的基因。GRP78基因片段及pIRES2-EGFP空載質(zhì)粒均用Pst I和BamH I酶切處理后回收帶有相同黏性末端的片段,用 T4連接酶連接,其他實(shí)驗(yàn)步驟如前述,測序后保存pGIE質(zhì)粒及菌種。⑶提取pGIE質(zhì)粒,用Pst I限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒線性化并凝膠電泳回收。用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將回收的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞DU145,用G418進(jìn)行抗性篩選并進(jìn)行單克隆化,在
6、熒光顯微鏡下觀察挑選出帶有綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)。對穩(wěn)定帶有熒光的細(xì)胞,進(jìn)一步進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定,并用Elisa檢測細(xì)胞上清中GRP78的分泌。選取分泌GRP78的細(xì)胞進(jìn)行保存培養(yǎng)及后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果:①GRP78刺激單核細(xì)胞THP1后,F(xiàn)CM檢測顯示CD163表達(dá)升高,且隨著GRP78刺激濃度升高而增加,RT-PCR檢測顯示在GRP78濃度為40ng/ml時FIZZ1、TGFβ有明顯的升高,F(xiàn)GL2的
7、表達(dá)則隨著GRP78濃度的增加而降低,而IL10、ARG1、iNOS的表達(dá)變化不明顯。②目的基因片段與pIRES2-EGFP空載體連接后,挑取篩選后藍(lán)白斑陽性菌落擴(kuò)增并提取質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳鑒定篩選出質(zhì)粒大小符合理論值(約7kb)的質(zhì)粒,酶切后電泳鑒定進(jìn)一步篩選出符合預(yù)期大小的質(zhì)粒樣品,測序結(jié)果與GRP78-?KDEL基因序列相符,所編碼氨基酸序列完全一致,結(jié)果表明pGIE真核核表達(dá)載體構(gòu)建成功。③在熒光顯微鏡下,觀察轉(zhuǎn)染pGIE質(zhì)粒
8、的DU145細(xì)胞形態(tài)及綠色熒光的表達(dá),選取熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的細(xì)胞進(jìn)行單克隆化并繼續(xù)G418加壓篩選,選取熒光強(qiáng)度強(qiáng)的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行綠色熒光檢測,收集轉(zhuǎn)染以及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞上清ELISA檢測,ELISA檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了pGIE質(zhì)粒的DU145細(xì)胞上清中GRP78較未轉(zhuǎn)染的有明顯升高。
結(jié)論:⑴GRP78可以促進(jìn)單核細(xì)胞THP1表面CD163、FIZZ1、TGFβ分子的表達(dá),而抑制FGL2的表達(dá),提示GRP78可
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