GRP78在原發(fā)性開(kāi)角型青光眼患者小梁細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的研究.pdf

1、目的：
　　 本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人眼小梁細(xì)胞，將衣霉素(Tunicamycin)、十字孢堿(Staurosporine)分別作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡處理因素，分子生物學(xué)方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)伴侶蛋白GRP78在體外培養(yǎng)的正常人及原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(POAG)病人眼小梁細(xì)胞內(nèi)mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。旨在從新的角度解釋GRP78在細(xì)胞凋亡中可能發(fā)揮的作用，以及因凋亡導(dǎo)致的小梁細(xì)胞數(shù)目減少進(jìn)而影響房水流出阻力的調(diào)節(jié)機(jī)制，為POA

2、G的發(fā)病機(jī)理的研究提供新的思路，為探討其治療措施提供新的方向。
　　 方法：
　　 1.人眼小梁細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定：
　　 1)組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)正常人小梁細(xì)胞(NTM)及POAG患者小梁細(xì)胞(GTM)
　　 2)顯微鏡觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)等方法鑒定人眼小梁細(xì)胞；
　　 2.藥物處理小梁細(xì)胞：
　　 1)將細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組和處理組，處理組細(xì)胞培養(yǎng)液分別添加Tunicamycin(Tm)

3、、Staurosporine(STS)、對(duì)照組添加dimethylsulfoxide(DMSO)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78表達(dá)的改變；
　　 2)應(yīng)用MTS法檢測(cè)Tm、STS對(duì)人眼小梁細(xì)胞的毒性；
　　 3.檢測(cè)人眼小梁細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)的差異：
　　 1)應(yīng)用Real-timePCR檢測(cè)人小梁細(xì)胞GRP78mRNA的表達(dá)；
　　 2)應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)人小梁細(xì)胞GRP7

4、8蛋白的表達(dá)；
　　 3)應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察GRP78蛋白與Myocilin蛋白的共定位情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.小梁網(wǎng)細(xì)胞鑒定：
　　 原代正常人和POAG患者小梁網(wǎng)細(xì)胞均表達(dá)FN、LN、NSE、vimentin；第Ⅷ因子陰性。
　　 2.藥物處理對(duì)小梁細(xì)胞的影響：
　　 1)形態(tài)觀察：光鏡下可見(jiàn)POAG患者與正常人，小梁細(xì)胞形態(tài)、分布上未見(jiàn)明顯差別；用Tm

5、、STS藥物處理后，小梁細(xì)胞胞突減少，細(xì)胞體積縮小，密度下降，STS處理組較TM組變化明顯，DMSO處理組小梁細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。
　　 2)MTS法檢測(cè)(細(xì)胞增殖檢測(cè))：1μM，1μM，10μM，30μM，100μMTm或0.03μM，0.1μM，0.3μM，0.9μM，1.2μMSTS培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后，NTM與GTM增殖均受抑制，GTM受抑制更為明顯，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；
　　 3.人眼小梁細(xì)胞內(nèi)GR

6、P78表達(dá)的差異：Real-timePCR和Western blot顯示相似的結(jié)果：
　　 1)原代POAG患者小梁網(wǎng)細(xì)胞內(nèi)GRP78水平明顯低于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2)Tm可增加正常人及POAG患者小梁細(xì)胞內(nèi)GRP78的表達(dá)水平，但后者的增高水平明顯低于前者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3)Tm對(duì)人小梁細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)水平的影響明顯大于STS，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

7、＜0.05)。
　　 4)GTM細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑STS的反應(yīng)大于NTM細(xì)胞。
　　 4.共聚焦顯微鏡觀察顯示
　　 1)POAG患者小梁細(xì)胞及Tm、STS處理過(guò)的正常人小梁細(xì)胞內(nèi)GRP78蛋白與Myocilin蛋白共定位，而未處理的正常人小梁細(xì)胞內(nèi)GRP78蛋白與Myocilin蛋白分布有差異；
　　 2)POAG患者小梁細(xì)胞及用Tm處理過(guò)的正常人小梁細(xì)胞內(nèi)GRP78出現(xiàn)核周聚集現(xiàn)象，而在正常人小梁細(xì)胞及