基因沉默與誘導(dǎo)雙向治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎.pdf

1、目的：
　　1.探索超聲微泡靶向破壞聯(lián)合轉(zhuǎn)染試劑Entranster能否提高aggrecanase-1基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；2.制備兔類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)估；3.超聲微泡靶向破壞聯(lián)合轉(zhuǎn)染試劑Entranster in vivo介導(dǎo)aggrecanase-1 shRNA，COX-2 shRNA，hIGF體內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)的影響。
　　方法：
　　應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者骨髓

2、間充質(zhì)干細(xì)胞。將第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于24孔板中，共分為4組：1.超聲靶向微泡破壞組（UTMD）;2.轉(zhuǎn)染試劑Entranster組（ENTR）;3.超聲微泡靶向破壞+轉(zhuǎn)染試劑Entranster組（UTMD+ENTR）;4.對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后第2天、第4天、第6天，在倒置熒光顯微鏡下，觀察aggrecanase shRNA轉(zhuǎn)染情況；應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后aggrecanase mRNA水平的變化。家兔類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型制備：應(yīng)用

3、牛Ⅱ型膠原溶液與完全弗氏佐劑混合成乳劑，取1 ml共分10點(diǎn)注射于家兔肩胛骨區(qū)域。致敏后，膝關(guān)節(jié)注入1ml(5g/L)膠原蛋白溶液，觀察足掌關(guān)節(jié)腫脹程度，對(duì)關(guān)節(jié)炎進(jìn)行評(píng)分以及病理學(xué)組織檢查。體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：將造模成功的兔類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型分為3組：空白對(duì)照組：僅在家兔右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射等量的PBS；單純質(zhì)粒組：取200ul Aggrecanase-2 shRNA（10ug）、COX-2 shRNA（10ug）、hIGF（10ug）質(zhì)粒以及10

4、0ul PBS注入家兔右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)；質(zhì)粒+Entranster-in vivo+超聲微泡組：各取200ul Aggrecanase-2 shRNA（10ug）、COX-2 shRNA（10ug）、IGF（10ug）、Entranster-in vivo轉(zhuǎn)染試劑以及100ul六氟化硫微泡液體注入家兔右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，在4.9MHz頻率下，超聲探頭掃右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)5分鐘。大體觀察比較各組間關(guān)節(jié)病變及改善情況；病理組織檢查各組間炎細(xì)胞有無(wú)減少；體內(nèi)

5、轉(zhuǎn)染4天后，切取各組右膝關(guān)節(jié)滑膜組織，用冰凍切片機(jī)切片，在熒光顯微鏡下觀察各組間基因轉(zhuǎn)染情況；RT-PCR檢測(cè)各組滑膜組織COX-2、aggrecanse表達(dá)水平；ELISA法檢測(cè)各組右膝關(guān)節(jié)灌洗液hIGF-I含量。
　　結(jié)果：
　　在倒置熒光顯微鏡下觀察UTMD+ENTR組綠色熒光最強(qiáng)；UTMD組和ENTR組次之，對(duì)照組最暗。轉(zhuǎn)染后各組間比較aggrecanase mRNA表達(dá)水平；UTMD+ENTR組下降最明顯。UTMD

6、聯(lián)合轉(zhuǎn)染試劑Entranster的轉(zhuǎn)染效率高于單純超聲輻照和Entranster轉(zhuǎn)染（P<0.01）；牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑混合乳劑皮下注射并誘導(dǎo)后，膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)直徑增加，皮膚溫度升高，1周后，病理切片鏡下滑膜組織內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：?jiǎn)渭冑|(zhì)粒組，關(guān)節(jié)腔注射后，滑膜組織制成冰凍切片后，熒光顯微鏡下觀察熒光微弱，質(zhì)粒+Entranster-in vivo+超聲微泡組，熒光顯微鏡下可見(jiàn)大量熒光彌漫于滑膜組織。Entrans

7、ter-in vivo+超聲微泡組的COX-2mRNA、aggrecanase mRNA表達(dá)水平明顯低于空包對(duì)照和單純質(zhì)粒組；各組間應(yīng)用ELISA法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)灌洗液hIGF-I含量比較后Entranster-in vivo+超聲微泡組水平最高。關(guān)節(jié)腔注射后兩周滑膜組織HE染色切片觀察，Entranster-in vivo+超聲微泡組炎細(xì)胞數(shù)量較其他兩組減少，但大體外觀見(jiàn)各組的關(guān)節(jié)修復(fù)沒(méi)有明顯差別。
　　結(jié)論：
　　UTMD聯(lián)