健脾化瘀方防治非小細胞肺癌的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、目的:觀察健脾化瘀方對人肺癌細胞株A549增殖的抑制作用、凋亡的作用及其對凋亡、炎癥氧化應(yīng)激相關(guān)基因的調(diào)節(jié)表達的影響;建立對C57BL/6小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型,并觀察健脾化瘀方對移植瘤生長曲線,移植瘤大小的影響及對C57BL/6小鼠免疫相關(guān)因素,脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響,及血清中炎癥相關(guān)因子表達的影響。
　　方法:(1)通過 MTT法,觀察不同濃度、不同時間健脾化瘀方作用于人肺癌A549細胞和鼠肺癌Lewis細胞增殖的抑

2、制作用。(2)通過 Annexin-V/PI雙染色法,運用流式細胞儀檢測研究不同濃度健脾化瘀方對人肺癌細胞株A549凋亡的誘導(dǎo)作用。(3)通過熒光顯微鏡觀察經(jīng)Hoechst33342的核染色后健脾化瘀方對于人肺癌細胞A549作用后的細胞凋亡形態(tài)變化,證實其凋亡的發(fā)生。(4)通過使用Real-time PCR方法檢測健脾化瘀方作用于 A549細胞對凋亡相關(guān)基因 Survivin,Bcl-2,β-catenin、BAX的 mRNA表達的影響

3、;炎癥以及氧化應(yīng)激相關(guān)基因IL-1β、TNF-α、Nrf2、HO-1、Twist的mRNA表達的影響。(5)通過使用Western Blotting方法檢測健脾化瘀方作用A549細胞后炎細胞因子MCP-1,IL-6, TGF-β1,以及細胞粘附分子 ICAM-1和核因子 NF-κB蛋白表達的影響。(6)通過建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型,觀察健脾化瘀方對C57BL/6小鼠皮下移植瘤瘤體體積,瘤生長曲線的影響,荷瘤鼠的

4、胸腺指數(shù),脾指數(shù)的影響。(7)運用ELISA檢測對荷瘤小鼠血清中炎性相關(guān)因子的表達的影響。
　　結(jié)果:體外實驗中健脾化瘀方(1、2、4 mg/mL)能明顯抑制A549細胞增殖并呈濃度依賴性,通過 Annexin V/PI流式細胞儀和 Hoechst33342染色結(jié)果表明,健脾化瘀方能夠誘導(dǎo)細胞凋亡,引起A549細胞核變化使得細胞核固縮,DNA和染色質(zhì)縮合和碎裂。通過 Real-time PCR方法檢測健脾化瘀方作用于 A549細胞

5、誘導(dǎo)其凋亡的可能機制與下調(diào)Survivin,Bcl-2,β-catenin;上調(diào)BAX基因的mRNA表達有關(guān);能夠下調(diào)細胞中 IL-1β、TNF-α、Nrf2、HO-1、Twist炎癥以及氧化應(yīng)激相關(guān)基因的 mRNA表達。通過 Western blotting免疫印跡分析表明,能夠使得A549細胞中炎細胞因子 MCP-1, IL-6, TGF-β1,以及細胞粘附分子ICAM-1和核因子 NF-κB的表達顯著降低。體內(nèi)實驗研究健脾化瘀方能

6、夠通過免疫作用抑制了Lewis肺癌C57BL/6小鼠腫瘤生長。健脾化瘀方對C57BL/6小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤有顯著的抑制作用,能夠顯著抑制小鼠腫瘤的體積、重量增長,高中低劑量健脾化瘀方的抑制率分別為:64.48±8.9％,54.12±17.72％,27.73±10.31％。除此之外,健脾化瘀方能夠顯著升高胸腺、脾臟指數(shù)。 ELISA檢測顯示健脾化瘀方能夠顯著降低荷瘤鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-8和IL-10的水平。研究結(jié)果

7、表明,健脾化瘀方能夠誘導(dǎo)非小細胞肺癌的腫瘤細胞的增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡,其作用機制可能與相關(guān)的炎癥反應(yīng)改善免疫系統(tǒng)有關(guān)。
　　結(jié)論:健脾化瘀方可明顯抑制肺癌細胞的增殖,并能夠誘導(dǎo)A549細胞凋亡其可能機制為調(diào)控凋亡、炎癥相關(guān)基因,以及下調(diào)炎癥細胞因子MCP-1,IL-6和TGF-β1水平,細胞核因子NF-κB的蛋白表達,以及細胞粘附分子 ICAM-1的表達有關(guān)。健脾化瘀方對 C57BL/6小鼠 Lewis肺癌皮下移植瘤有顯著的抑制作用