昆蟲病原真菌對(duì)楊尺蠖蛹的致病力研究.pdf

1、楊尺蠖，又名春尺蠖（Apocheima cinerarius Erschoff），是楊樹上一種暴發(fā)性食葉害蟲，每年三月下旬到五月初楊尺蠖幼蟲上樹取食。蟲口密度大時(shí)可將整株葉片吃光，造成樹木枯死。以往以噴霧殺蟲劑防治樹上幼蟲為主。本碩士論文利用楊尺蠖老熟幼蟲下樹入土，在土內(nèi)化蛹越夏和越冬9個(gè)月的習(xí)性，開展了應(yīng)用昆蟲病原真菌進(jìn)行生物防治的研究。本研究楊尺蠖的發(fā)生和采集地在山西省洪洞縣楊樹豐產(chǎn)林，蛹的三個(gè)發(fā)育期采樣分別在5月、7月和10月，蛹

2、的形態(tài)特征和內(nèi)部解剖在OLYMPUS體視顯微鏡下完成。選用本實(shí)驗(yàn)室保存的三株球孢白僵菌作為試驗(yàn)菌種， TST05菌株是從桃小食心蟲 Carposina niponensis Walsingham越冬幼蟲上分離的病原菌；FDB01菌株是從帕克阿扁葉蜂Acantholyda parki上分離的病原菌；SYN01菌株，購(gòu)買于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為 CGMCC3.4428，寄主為松毛蟲 Dendrolimus kikuchii M

3、atsumura。研究了這三株菌對(duì)不同發(fā)育期楊尺蠖蛹的致病力，并從自然染菌的楊尺蠖蛹上分離獲得1株病原真菌。
　　內(nèi)容包括：
　?。?）三個(gè)發(fā)育時(shí)期楊尺蠖蛹的外部形態(tài)特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察，以及TST05、FDB01和SYN01菌株對(duì)其致死率的比較；
　?。?）球孢白僵菌侵染楊尺蠖蛹體表的過程、病原菌胞外酶活力的變化測(cè)定以及楊尺蠖蛹表皮成分含量的測(cè)定；
　　（3）從自然染菌的楊尺蠖蛹上分離獲得1株病原真菌的分離、純

4、化，培養(yǎng)特征、形態(tài)特征的電鏡觀察和菌種的分子鑒定。
　　結(jié)果如下：
　　1.楊尺蠖蛹在三個(gè)發(fā)育時(shí)期的外部形態(tài)和內(nèi)部解剖的結(jié)果顯示，特征前期、中期和后期大致相同，有復(fù)眼、觸角、中胸氣門、翅芽和臀棘等結(jié)構(gòu)。前期蛹和中期蛹體表為黃棕色，后期蛹為灰褐色。不同時(shí)期的蛹內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化很大。前期蛹蟲體未發(fā)育完全，只看到直腸囊位于中央。中期蛹基本發(fā)育完全，已經(jīng)分化出中腸和馬氏管等結(jié)構(gòu)。后期雌蛹體內(nèi)出現(xiàn)了卵。
　　染菌實(shí)驗(yàn)說明：三菌株均能

5、侵染楊尺蠖的蛹，死亡蟲體繼續(xù)培養(yǎng)后長(zhǎng)出白色菌絲。雖然各時(shí)期楊尺蠖蛹的校正死亡率隨時(shí)間變化曲線不相同，但是染菌4d后，TST05菌株對(duì)蛹的校正死亡率一直保持最高的趨勢(shì)。染菌8d后，三個(gè)時(shí)期TST05菌株對(duì)楊尺蠖蛹的校正死亡率都是最高，致死率分別為71.05％、70.73%和61.18%，與其他菌株差異顯著。LT50最小，分別為4.76d、4.91d和5.60d。TST05菌株對(duì)前期和中期蛹的校正死亡率較高，在70%以上，各時(shí)期之間差異顯著

6、。前期和中期LT50都低于5d。說明：球孢白僵菌TST05在楊尺蠖蛹期的地下防治中有較大的潛力，5月化蛹初期和7、8月雨季是防治的最佳時(shí)期。
　　2.用球孢白僵菌菌株TST05孢子懸浮液（1×108孢子·mL-1）感染楊尺蠖后期蛹，在掃描電鏡下觀察侵染過程，發(fā)現(xiàn)楊尺蠖蛹腹部有許多分布不均勻的刻點(diǎn)。球孢白僵菌分生孢子在刻點(diǎn)處、腹部氣門處、體壁上附著并萌發(fā)生出菌絲。菌絲穿透體壁后，在楊尺蠖蛹表皮背面覆蓋并繼續(xù)生長(zhǎng)，并穿透在蛹?xì)?nèi)已發(fā)育

7、為成蟲的蟲體體壁，進(jìn)入體腔。
　　以不同發(fā)育期的楊尺蠖蛹表皮為唯一碳氮源，測(cè)定三株菌的蛋白質(zhì)酶、幾丁質(zhì)酶和脂肪酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論以前期、中期，還是后期蛹的表皮為碳氮源， TST05和 FDB01菌株對(duì)體壁蛋白質(zhì)分解能力較強(qiáng)，酶活最大值分別達(dá)到4.581±0.392 U/ml和5.753±0.095 U/ml；SYN01菌株對(duì)體壁蛋白質(zhì)分解能力較弱，最大值達(dá)到4.247±0.368 U/ml；以前期蛹表皮為唯一碳氮源，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

8、示，三菌株TST05、FDB01和SYN01分解表皮幾丁質(zhì)能力相當(dāng)，最大值分別達(dá)到0.206±0.005 U/ml、0.193±0.014 U/ml和0.200±0.012 U/ml；以中期蛹和后期蛹為唯一碳氮源，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SYN01菌株分解表皮幾丁質(zhì)的能力最強(qiáng)，最大值達(dá)到0.379±0.019 U/ml；TST05菌株次之，最大值達(dá)到0.346±0.036 U/ml；FDB01菌株最弱，最大值達(dá)到0.347±0.044 U/ml。

9、不論以前期、中期，還是后期蛹的表皮為碳源， TST05菌株對(duì)表皮脂肪分解能力最強(qiáng)，脂肪酶的活性最大值為1.475±0.314 U/ml；FDB01次之，脂肪酶的酶活最大值為1.300±0.372 U/ml；SYN01最差，脂肪酶的酶活最大值為1.053±0.240 U/ml。
　　同時(shí)測(cè)定了不同發(fā)育期蛹的表皮成分，在三個(gè)發(fā)育期，每0.1 g表皮，蛋白質(zhì)含量分別為0.055±0.002 g、0.053±0.004 g和0.052±0

10、.003 g，三者差異性不顯著。幾丁質(zhì)含量分別為0.021±0.001 g、0.023±0.004 g和0.026±0.002 g，后期含量比前期含量高且差異性顯著，與中期相比差異性不明顯。脂肪含量分別為0.025±0.001 g、0.024±0.001 g和0.022±0.003 g，三者差異性也不顯著。對(duì)比不同發(fā)育期楊尺蠖蛹的致死率和胞外酶活性發(fā)現(xiàn)，在表皮成分中，蛋白含量最多，而胞外蛋白酶在致死楊尺蠖蛹的過程中起到了重要作用。在蛹的

11、發(fā)育后期，幾丁質(zhì)含量明顯增多，這時(shí)幾丁質(zhì)酶活性在致死楊尺蠖蛹的過程中起到重要作用。由于蛹體內(nèi)含有大量脂肪，在菌絲進(jìn)入體腔后，脂肪酶發(fā)揮了重要作用。而 TST05菌株在分解蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和脂肪的能力均較強(qiáng)，所以TST05是篩選出的最優(yōu)菌株。
　　3.從野外采集的自然染菌的楊尺蠖蛹蟲尸上分離出1株菌編號(hào)為YHT01?；亟託⑾x試驗(yàn)后，根據(jù)染病癥狀確認(rèn)該菌為楊尺蠖蛹的致病菌株。YHT01菌株在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈橢圓形，白色，絨毛狀，菌

12、落背面中央呈橙黃色。電鏡觀察顯示，該菌株的孢梗束呈掃帚狀，瓶狀小梗輪生或單生于分生孢子梗上，瓶狀小梗直徑0.4~1.1μm，長(zhǎng)4.2~13.1μm；分生孢子小，卵形至橢圓形，壁光滑。在NCBI上將菌株YHT01的ITS基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株YHT01與Paecilomyces farinosus的同源性達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)觀察和分子鑒定結(jié)果，判斷該菌株為擬青霉屬（paecilomyces）的粉質(zhì)擬青霉（paecilomy