半胱胺、胱氨酸和卵丘細胞在提高山羊裸卵GSH水平及發(fā)育能力中的作用.pdf

1、體外成熟(IVM)之前脫去卵丘細胞會嚴重損傷卵母細胞的胚胎發(fā)育能力和谷胱甘肽(GSH)合成的能力。裸卵(DOs)體外成熟質(zhì)量的低下嚴重限制了諸如生發(fā)泡(GV)移植，體細胞單倍體化以及GV期卵母細胞冷凍保存等胚胎工程技術的發(fā)展。目前研究人員所應用的多種DOs體外成熟系統(tǒng)都只能部分改善其發(fā)育潛能。此外，我們目前對卵丘細胞促進卵母細胞成熟質(zhì)量的機制還知之甚少。因此，建立一種完善的DOs體外成熟系統(tǒng)具有非常重要的應用價值和理論意義。在本實驗中，

2、我們以山羊為實驗動物，比較了不同形式的卵丘細胞(分散的卵丘細胞、卵丘細胞單層以及卵丘卵母細胞復合體)共培養(yǎng)對山羊DOs胚胎發(fā)育能力的影響，卵丘細胞單層培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液中添加激素成分(FSH、LH、17β-E2)對卵丘細胞黃體化的抑制作用，此外還詳細研究了半胱胺、胱氨酸以及卵丘細胞之間相互作用對山羊裸卵體外成熟后胞質(zhì)中GSH水平以及發(fā)育能力的影響，以期建立一種高效完善的DOs體外成熟系統(tǒng)并對卵丘細胞促進卵母細胞成熟機制進行深入探討。實驗結

3、果表明： 1、山羊DOs的體外成熟率和孤雌激活后的胚胎發(fā)育能力都顯著低于卵丘卵母細胞復合體(COCs)(p＜0.05)，各種形式的卵丘細胞均能顯著提高裸卵的體外成熟率以及胚胎發(fā)育到桑椹胚的能力(p＜0.05)，但對其囊胚發(fā)育率并沒有明顯的改善(p＞0.05)。與分散的卵丘細胞(DCCs)和COCs相比，卵丘細胞單層對于裸卵桑椹胚率的提高更明顯。 2、卵丘細胞單層培養(yǎng)過程中，當培養(yǎng)液中含有激素成分(FSH、LH、17β-E

4、2)時，培養(yǎng)5天后其中的孕酮的含量與無細胞的對照組培養(yǎng)液差異不顯著(p＞0.05)，當不添加激素時卵丘細胞向培養(yǎng)液中釋放的孕酮量大大增加(p＜0.05)。說明培養(yǎng)過程中激素的存在能夠顯著抑制卵丘細胞的黃體化。 3、成熟培養(yǎng)液中添加半胱胺能夠濃度依賴性的提高COCs胞質(zhì)中的GSH水平。當半胱胺濃度為100μM時，孤雌激活后囊胚發(fā)育率最高，隨著半胱胺濃度進一步升高，囊胚率反而下降，囊胚細胞數(shù)的變化趨勢也與之類似。 4、成熟培

5、養(yǎng)液中添加胱氨酸能夠濃度依賴性的提高COCs胞質(zhì)中的GSH水平，當胱氨酸濃度為200μM時，孤雌激活后囊胚發(fā)育率最高，隨著胱氨酸濃度進一步升高，囊胚率反而下降，囊胚細胞數(shù)的變化趨勢也與之類似。 5、向培養(yǎng)液中同時添加半胱胺(100μM)和胱氨酸(200μM)能夠使山羊COCs的囊胚發(fā)育率明顯提高(p＜0.05)，但是對成熟后胞質(zhì)中的GSH水平并沒有進一步的影響(p＞0.05)。增加半胱胺和胱氨酸的含量(200μMand500μM

6、respectively)并沒有繼續(xù)提高山羊COCs的囊胚發(fā)育能力和胞質(zhì)中GSH水平。 6、山羊裸卵的體外成熟、胞質(zhì)中GSH合成能力以及胚胎發(fā)育能力都顯著低于COCs(p＜0.05)，向成熟培養(yǎng)液TCM-199中添加半胱胺能夠顯著提高山羊DOs的以上指標，但是添加胱氨酸對DOs的體外成熟，胚胎發(fā)育和GSH合成情況都沒有任何改善。與單獨添加半胱胺相比，同時添加時半胱胺和胱氨酸則能夠明顯改善山羊DOs的體外成熟，囊胚發(fā)育以及GSH合

7、成能力(p＜0.05)。說明山羊裸卵本身能夠利用培養(yǎng)液中的半胱胺，但不能利用培養(yǎng)液中的胱氨酸，半胱胺能夠促進山羊裸卵對胱氨酸的利用。 7、在卵丘細胞單層存在的情況下，向成熟培養(yǎng)液中單獨添加半胱胺或者胱氨酸都能明顯改善山羊DOs的囊胚發(fā)育以及GSH合成能力，當二者同時存在時囊胚發(fā)育情況得到進一步提高(p＜0.05)，囊胚細胞數(shù)也較單獨添加巰基物質(zhì)時明顯增多(p＜0.05)，達到與不添加任何巰基物質(zhì)時COCs類似的水平，但胞質(zhì)GSH