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文檔簡介
1、概述:
冷凍治療腫瘤已有數(shù)十年歷史。近年來,隨著冷凍設(shè)備的更新和冷凍技術(shù)的完善,在準(zhǔn)確定位腫瘤和最大限度殺滅腫瘤組織等方面取得了長足的進(jìn)步。
冷凍的作用主要就是使局部快速降溫、凍結(jié)、復(fù)溫,在此過程中產(chǎn)生一系列的病理變化,最終導(dǎo)致細(xì)胞受損而死亡。由細(xì)胞內(nèi)、外液中因凍結(jié)而分離出的純水形成冰晶,并由此而產(chǎn)生的一系列變化是冷凍致組織損傷的重要機(jī)制。冷凍治療過程中還存在冷凍速度的區(qū)別,因此致細(xì)胞損傷的作用機(jī)制可能也存在
2、一些差別。目前關(guān)于冷凍致細(xì)胞死亡的機(jī)制主要存在以下幾種學(xué)說:①迅速的低溫使細(xì)胞內(nèi)外的水分形成冰晶,細(xì)胞脫水,細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃度增高,使脂蛋白復(fù)合體受到破壞,引起細(xì)胞膜的溶解損傷從而致細(xì)胞死亡;②冷凍還可傷害線粒體中的光磷酸化作用,使三磷酸腺苷的合成發(fā)生不可逆性的裂解,造成細(xì)胞器膜的損害,而琥珀酸脫氫酶的活性有賴于線粒體膜的完整性,溶酶體膜的破壞可導(dǎo)致其中酶的釋放,引起細(xì)胞的自溶,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核的膜均可在冷凍過程中發(fā)生破裂,而細(xì)胞可因細(xì)胞器
3、的破壞而發(fā)生死亡;③冷凍過程中由于細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成,可造成細(xì)胞內(nèi)的脫水狀態(tài),體液濃縮,細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃縮,濃度達(dá)到有害的程度,同時酸堿度也隨之改變,出現(xiàn)細(xì)胞酸中毒和代謝障礙,從而導(dǎo)致胞漿、胞膜、細(xì)胞內(nèi)成分蛋白產(chǎn)生變性,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡;④冷凍還可使細(xì)胞膜、蛋白等細(xì)胞成分中的結(jié)構(gòu)水丟失,細(xì)胞因此失去功能而死亡;⑤溫度休克學(xué)說認(rèn)為溫度的急劇變化較絕對溫度對細(xì)胞的殺傷作用更重要,這可能是由于細(xì)胞內(nèi)組成成分縮脹比率不均衡以致細(xì)胞破裂的結(jié)果;⑥組織
4、冷凍后,血流速度減慢,這在小靜脈表現(xiàn)的尤為明顯,小靜脈出現(xiàn)血流郁滯,這種血流郁滯乃至造成微循環(huán)的阻斷,另外,冷凍還可直接損傷毛細(xì)血管壁,使血小板和其他血細(xì)胞與損傷的血管壁黏附,在血管內(nèi)形成血栓栓塞。毛細(xì)血管腔出現(xiàn)阻塞后,則血流停止,組織細(xì)胞出現(xiàn)缺血性梗死。
冷凍后繼發(fā)的組織細(xì)胞壞死還與冷凍后所引起的一系列生化反應(yīng)有關(guān)。冷凍致細(xì)胞死亡的機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。凋亡是與壞死不同的另一種細(xì)胞死亡機(jī)制,即程序性死亡,它是一種耗能的
5、主動的促細(xì)胞消亡的方式。我們前期研究已證實(shí)冷凍治療可引起腫瘤中心區(qū)壞死、周邊腫瘤細(xì)胞凋亡。而冷凍免疫是冷凍治療的又一重要機(jī)制。全身冷凍免疫實(shí)驗(yàn)表明,冷凍HCA實(shí)體瘤,除原瘤生長受抑制外,還可能產(chǎn)生腫瘤特異性移植免疫以及抑制再植瘤生長。Bayjoo實(shí)驗(yàn)顯示NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性在冷凍后增強(qiáng),臨床也偶見原發(fā)灶經(jīng)冷凍后轉(zhuǎn)移灶自行退縮現(xiàn)象。Joosten等在冷凍治療小鼠皮膚腫瘤(colon26-B)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)除局部腫瘤壞死外,還可誘導(dǎo)全身抗腫瘤反應(yīng)
6、,血漿中IL-1和TNF-α水平較直接切除組高。由此可見冷凍本身能改變機(jī)體免疫狀態(tài),為聯(lián)合TNF-α治療提供了條件。
TNF-α的眾多生物學(xué)作用中,其抗瘤作用倍受人們關(guān)注。大量實(shí)驗(yàn)研究和初步臨床應(yīng)用的資料證實(shí)TNF-α對某些腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞抑制和殺傷作用。TNF的抗癌作用主要是由于:①TNF為激發(fā)性細(xì)胞因子,可啟動廣泛的免疫炎性反應(yīng),介導(dǎo)天然細(xì)胞毒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞.對癌細(xì)胞的殺傷和溶瘤作用;②TNF可作用于血管內(nèi)皮
7、細(xì)胞,使腫瘤的血管變形受損或形成血栓,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生出血性壞死或因營養(yǎng)缺乏而消退;③TNF可通過誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞凋亡來抑制癌細(xì)胞增生。由于其毒副作用和劑量依賴性,TNF-α常與放療,化療(VP16,5-Fu,MMC,ADM等),熱療等聯(lián)合用藥,以提高其抗瘤作用,減少其用量和副作用。
腦膠質(zhì)瘤約占腦腫瘤總數(shù)的40%~50%,平均生存期僅為51周,多采用手術(shù)切除、放療、化療等治療手段,但復(fù)發(fā)率高,預(yù)后仍不理想。若將冷凍與免疫治療
8、聯(lián)合應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤的治療,其療效如何,國內(nèi)外鮮見報道。本實(shí)驗(yàn)采用冷凍聯(lián)合免疫增強(qiáng)劑——TNF-α治療腦膠質(zhì)瘤,探討其殺瘤機(jī)制,評價其療效,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
本課題分三個部分:
第一部分:建立大鼠皮層C6腦膠質(zhì)瘤模型,為腦膠質(zhì)瘤的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。借助于腦立體定位技術(shù),在雄性Wistar大鼠腦S1區(qū)接種C6細(xì)胞懸液。隨機(jī)分成4個周組和1個自然死亡組后觀察大鼠的生存期,并采用MRI、病理解剖、HE染色及G
9、FAP免疫組織化學(xué)方法,動態(tài)觀察各周組腫瘤生長情況。以了解模型的穩(wěn)定性。
第二部分:冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療C6大鼠腦膠質(zhì)瘤。本部分通過TUNEL法、流式細(xì)胞儀、免疫組化、MRI等手段觀察大鼠C6腦膠質(zhì)瘤經(jīng)冷凍、rhTNF-α及冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療后,腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的數(shù)目、p21WAF1/CIP1和PCNA的表達(dá)、腫瘤體積、荷瘤鼠生存期、及凋亡、p21WAF1/CIP1、PCNA三者之間的相互關(guān)系,以探討它們殺傷
10、腫瘤細(xì)胞的作用和機(jī)制,為冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質(zhì)瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
第三部分冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質(zhì)瘤的臨床研究,對通過MRI初步判斷為腦膠質(zhì)瘤患者采用冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療。觀察rhTNF-α毒副作用,出院前及以后每6個月復(fù)查一次MRI。了解聯(lián)合治療可否降低復(fù)發(fā)率,延長病人的生存時間,能否推廣應(yīng)用。
第一部分:大鼠皮層C6腦膠質(zhì)瘤模型的建立
目的:為腦膠質(zhì)瘤
11、的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),建立穩(wěn)定可靠的動物模型。方法:借助于腦立體定位技術(shù),在25只雄性Wistar大鼠腦S1區(qū)接種含有10g/L瓊脂糖的C6細(xì)胞懸液。隨機(jī)分成4個周組和1個自然死亡組后觀察大鼠的生存期,并采用MRI、病理解剖、HE染色及GFAP免疫組織化學(xué)方法,動態(tài)觀察各周組腫瘤生長情況。結(jié)果:在不同周組中,所有檢查均顯示C6腦膠質(zhì)瘤模型的建立成功,GFAP陽性。4周內(nèi)無死亡,自然死亡組在第5周死亡2只、余3只于第6周死亡。結(jié)論:該方法建
12、立的S1區(qū)腦膠質(zhì)瘤模型具備與人腦膠質(zhì)瘤生長相似的特性,腫瘤形成時間短,生存期穩(wěn)定,且無腦外轉(zhuǎn)移和顱外擴(kuò)散,適合各種腦膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)治療研究。
第二部分:冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療C6大鼠腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究
目的:本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠C6腦膠質(zhì)瘤經(jīng)冷凍、免疫(rhTNF-α)及冷凍聯(lián)合免疫(rhTNF-α)治療后,腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的數(shù)目、p21WAF1/CIP1和PCNA的表達(dá)、腫瘤體積、荷瘤鼠生存期、及凋亡、p21
13、WAF1/CIP1、PCNA三者之間的相互關(guān)系,以探討它們殺傷腫瘤細(xì)胞的作用和機(jī)制,為冷凍聯(lián)合免疫(rhTNF-α)療法的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
方法:本研究包括(1)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng),C6細(xì)胞在含有10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,5%-氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)。(2)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤動物模型的建立,選純種Wistar雄性大鼠120只,借助于立體定位技術(shù)、將10μl含有1×106個C6細(xì)胞懸液緩慢注射入大鼠右側(cè)
14、大腦S1區(qū)皮層。(3)動物分組及治療的實(shí)施:待腫瘤生長至第14天、直徑約6mm時,隨機(jī)將荷瘤鼠分為對照、單冷、單免(rhTNF-α)及凍免(rhTNF-α)四組,每組30只,對不同的組別進(jìn)行相應(yīng)的治療。于接種后第21天,每組隨機(jī)抽取20只按不同檢測要求取材,各組余10只用于測量腫瘤體積和觀察生存期。(4)TUNEL法和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。(5)免疫組化方法觀察p21WAF1/CIP1及PCNA蛋白的表達(dá)。(6)MRI測腫瘤體積。(7
15、)直接觀察各組荷瘤鼠的生存期。
結(jié)果:HE染色顯示顱內(nèi)腫瘤形成;GFAP陽性。聯(lián)合治療(凍免組)與其他三組比較:腫瘤細(xì)胞凋亡、p21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)顯著增多,PCNA蛋白表達(dá)顯著減少,腫瘤體積縮小,生存期延長。凋亡細(xì)胞數(shù)與p21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)呈正相關(guān);與PCNA蛋白表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān);p21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)也與PCNA蛋白表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)。
結(jié)論:凋亡是冷凍、免疫(rhT
16、NF-α)殺傷腫瘤細(xì)胞的一個重要機(jī)制;冷凍聯(lián)合免疫(rhTNF-α)治療可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng);p21WAF1/CIP1參與了凋亡的調(diào)控;PCNA參與DNA的合成,其下調(diào)反應(yīng)細(xì)胞增殖受抑制,有利于凋亡的發(fā)生,其表達(dá)受p21WAF1/CIP1負(fù)調(diào)控。
第三部分冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質(zhì)瘤的臨床觀察
目的:探討冷凍切除聯(lián)合重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-α)治療腦膠質(zhì)瘤的效果。
方法:對于18例腦
17、膠質(zhì)瘤患者采用冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療。觀察rhTNF-α毒副作用,出院前及以后每6個月復(fù)查一次MRI評估治療。
結(jié)果:腫瘤全切除17例,1例次全切除。術(shù)前9例有病例對側(cè)肢力減退者,均在1周內(nèi)恢復(fù)。rhTNF-α常見的毒副作用為發(fā)熱,局部紅腫及肌肉疼痛發(fā)生率為38.9%(7/18)。術(shù)后隨訪6~20個月,除1例次全切者術(shù)后15個月死亡外,余17例均幸存。
結(jié)論:本結(jié)果提示冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療腦
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