冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用研究.pdf

1、概述：
　　 冷凍治療腫瘤已有數(shù)十年歷史。近年來(lái)，隨著冷凍設(shè)備的更新和冷凍技術(shù)的完善，在準(zhǔn)確定位腫瘤和最大限度殺滅腫瘤組織等方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。
　　 冷凍的作用主要就是使局部快速降溫、凍結(jié)、復(fù)溫，在此過(guò)程中產(chǎn)生一系列的病理變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞受損而死亡。由細(xì)胞內(nèi)、外液中因凍結(jié)而分離出的純水形成冰晶，并由此而產(chǎn)生的一系列變化是冷凍致組織損傷的重要機(jī)制。冷凍治療過(guò)程中還存在冷凍速度的區(qū)別，因此致細(xì)胞損傷的作用機(jī)制可能也存在

2、一些差別。目前關(guān)于冷凍致細(xì)胞死亡的機(jī)制主要存在以下幾種學(xué)說(shuō):①迅速的低溫使細(xì)胞內(nèi)外的水分形成冰晶，細(xì)胞脫水，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃度增高，使脂蛋白復(fù)合體受到破壞，引起細(xì)胞膜的溶解損傷從而致細(xì)胞死亡;②冷凍還可傷害線粒體中的光磷酸化作用，使三磷酸腺苷的合成發(fā)生不可逆性的裂解，造成細(xì)胞器膜的損害，而琥珀酸脫氫酶的活性有賴于線粒體膜的完整性，溶酶體膜的破壞可導(dǎo)致其中酶的釋放，引起細(xì)胞的自溶，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核的膜均可在冷凍過(guò)程中發(fā)生破裂，而細(xì)胞可因細(xì)胞器

3、的破壞而發(fā)生死亡;③冷凍過(guò)程中由于細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成，可造成細(xì)胞內(nèi)的脫水狀態(tài)，體液濃縮，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃縮，濃度達(dá)到有害的程度，同時(shí)酸堿度也隨之改變，出現(xiàn)細(xì)胞酸中毒和代謝障礙，從而導(dǎo)致胞漿、胞膜、細(xì)胞內(nèi)成分蛋白產(chǎn)生變性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡;④冷凍還可使細(xì)胞膜、蛋白等細(xì)胞成分中的結(jié)構(gòu)水丟失，細(xì)胞因此失去功能而死亡;⑤溫度休克學(xué)說(shuō)認(rèn)為溫度的急劇變化較絕對(duì)溫度對(duì)細(xì)胞的殺傷作用更重要，這可能是由于細(xì)胞內(nèi)組成成分縮脹比率不均衡以致細(xì)胞破裂的結(jié)果;⑥組織

4、冷凍后，血流速度減慢，這在小靜脈表現(xiàn)的尤為明顯，小靜脈出現(xiàn)血流郁滯，這種血流郁滯乃至造成微循環(huán)的阻斷，另外，冷凍還可直接損傷毛細(xì)血管壁，使血小板和其他血細(xì)胞與損傷的血管壁黏附，在血管內(nèi)形成血栓栓塞。毛細(xì)血管腔出現(xiàn)阻塞后，則血流停止，組織細(xì)胞出現(xiàn)缺血性梗死。
　　 冷凍后繼發(fā)的組織細(xì)胞壞死還與冷凍后所引起的一系列生化反應(yīng)有關(guān)。冷凍致細(xì)胞死亡的機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。凋亡是與壞死不同的另一種細(xì)胞死亡機(jī)制，即程序性死亡，它是一種耗能的

5、主動(dòng)的促細(xì)胞消亡的方式。我們前期研究已證實(shí)冷凍治療可引起腫瘤中心區(qū)壞死、周邊腫瘤細(xì)胞凋亡。而冷凍免疫是冷凍治療的又一重要機(jī)制。全身冷凍免疫實(shí)驗(yàn)表明，冷凍HCA實(shí)體瘤，除原瘤生長(zhǎng)受抑制外，還可能產(chǎn)生腫瘤特異性移植免疫以及抑制再植瘤生長(zhǎng)。Bayjoo實(shí)驗(yàn)顯示NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性在冷凍后增強(qiáng)，臨床也偶見(jiàn)原發(fā)灶經(jīng)冷凍后轉(zhuǎn)移灶自行退縮現(xiàn)象。Joosten等在冷凍治療小鼠皮膚腫瘤（colon26-B）實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)除局部腫瘤壞死外，還可誘導(dǎo)全身抗腫瘤反應(yīng)

6、，血漿中IL-1和TNF-α水平較直接切除組高。由此可見(jiàn)冷凍本身能改變機(jī)體免疫狀態(tài)，為聯(lián)合TNF-α治療提供了條件。
　　 TNF-α的眾多生物學(xué)作用中，其抗瘤作用倍受人們關(guān)注。大量實(shí)驗(yàn)研究和初步臨床應(yīng)用的資料證實(shí)TNF-α對(duì)某些腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞抑制和殺傷作用。TNF的抗癌作用主要是由于:①TNF為激發(fā)性細(xì)胞因子，可啟動(dòng)廣泛的免疫炎性反應(yīng)，介導(dǎo)天然細(xì)胞毒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞.對(duì)癌細(xì)胞的殺傷和溶瘤作用;②TNF可作用于血管內(nèi)皮

7、細(xì)胞，使腫瘤的血管變形受損或形成血栓，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生出血性壞死或因營(yíng)養(yǎng)缺乏而消退;③TNF可通過(guò)誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)抑制癌細(xì)胞增生。由于其毒副作用和劑量依賴性，TNF-α常與放療，化療（VP16，5-Fu，MMC，ADM等），熱療等聯(lián)合用藥，以提高其抗瘤作用，減少其用量和副作用。
　　 腦膠質(zhì)瘤約占腦腫瘤總數(shù)的40％～50％，平均生存期僅為51周，多采用手術(shù)切除、放療、化療等治療手段，但復(fù)發(fā)率高，預(yù)后仍不理想。若將冷凍與免疫治療

8、聯(lián)合應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤的治療，其療效如何，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用冷凍聯(lián)合免疫增強(qiáng)劑——TNF-α治療腦膠質(zhì)瘤，探討其殺瘤機(jī)制，評(píng)價(jià)其療效，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 本課題分三個(gè)部分:
　　 第一部分:建立大鼠皮層C6腦膠質(zhì)瘤模型，為腦膠質(zhì)瘤的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。借助于腦立體定位技術(shù)，在雄性Wistar大鼠腦S1區(qū)接種C6細(xì)胞懸液。隨機(jī)分成4個(gè)周組和1個(gè)自然死亡組后觀察大鼠的生存期，并采用MRI、病理解剖、HE染色及G

9、FAP免疫組織化學(xué)方法，動(dòng)態(tài)觀察各周組腫瘤生長(zhǎng)情況。以了解模型的穩(wěn)定性。
　　 第二部分:冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療C6大鼠腦膠質(zhì)瘤。本部分通過(guò)TUNEL法、流式細(xì)胞儀、免疫組化、MRI等手段觀察大鼠C6腦膠質(zhì)瘤經(jīng)冷凍、rhTNF-α及冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療后，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的數(shù)目、p21WAF1/CIP1和PCNA的表達(dá)、腫瘤體積、荷瘤鼠生存期、及凋亡、p21WAF1/CIP1、PCNA三者之間的相互關(guān)系，以探討它們殺傷

10、腫瘤細(xì)胞的作用和機(jī)制，為冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質(zhì)瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 第三部分冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質(zhì)瘤的臨床研究，對(duì)通過(guò)MRI初步判斷為腦膠質(zhì)瘤患者采用冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療。觀察rhTNF-α毒副作用，出院前及以后每6個(gè)月復(fù)查一次MRI。了解聯(lián)合治療可否降低復(fù)發(fā)率，延長(zhǎng)病人的生存時(shí)間，能否推廣應(yīng)用。
　　 第一部分:大鼠皮層C6腦膠質(zhì)瘤模型的建立
　　 目的:為腦膠質(zhì)瘤

11、的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，建立穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。方法:借助于腦立體定位技術(shù)，在25只雄性Wistar大鼠腦S1區(qū)接種含有10g/L瓊脂糖的C6細(xì)胞懸液。隨機(jī)分成4個(gè)周組和1個(gè)自然死亡組后觀察大鼠的生存期，并采用MRI、病理解剖、HE染色及GFAP免疫組織化學(xué)方法，動(dòng)態(tài)觀察各周組腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果:在不同周組中，所有檢查均顯示C6腦膠質(zhì)瘤模型的建立成功，GFAP陽(yáng)性。4周內(nèi)無(wú)死亡，自然死亡組在第5周死亡2只、余3只于第6周死亡。結(jié)論:該方法建

12、立的S1區(qū)腦膠質(zhì)瘤模型具備與人腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)相似的特性，腫瘤形成時(shí)間短，生存期穩(wěn)定，且無(wú)腦外轉(zhuǎn)移和顱外擴(kuò)散，適合各種腦膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)治療研究。
　　 第二部分:冷凍聯(lián)合rhTNF-α治療C6大鼠腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察大鼠C6腦膠質(zhì)瘤經(jīng)冷凍、免疫(rhTNF-α)及冷凍聯(lián)合免疫(rhTNF-α)治療后，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的數(shù)目、p21WAF1/CIP1和PCNA的表達(dá)、腫瘤體積、荷瘤鼠生存期、及凋亡、p21

13、WAF1/CIP1、PCNA三者之間的相互關(guān)系，以探討它們殺傷腫瘤細(xì)胞的作用和機(jī)制，為冷凍聯(lián)合免疫(rhTNF-α)療法的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：本研究包括(1)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，C6細(xì)胞在含有10％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5％-氧化碳、37℃條件下培養(yǎng)。(2)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的建立，選純種Wistar雄性大鼠120只，借助于立體定位技術(shù)、將10μl含有1×106個(gè)C6細(xì)胞懸液緩慢注射入大鼠右側(cè)

14、大腦S1區(qū)皮層。(3)動(dòng)物分組及治療的實(shí)施:待腫瘤生長(zhǎng)至第14天、直徑約6mm時(shí)，隨機(jī)將荷瘤鼠分為對(duì)照、單冷、單免(rhTNF-α)及凍免(rhTNF-α)四組，每組30只，對(duì)不同的組別進(jìn)行相應(yīng)的治療。于接種后第21天，每組隨機(jī)抽取20只按不同檢測(cè)要求取材，各組余10只用于測(cè)量腫瘤體積和觀察生存期。(4)TUNEL法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。(5)免疫組化方法觀察p21WAF1/CIP1及PCNA蛋白的表達(dá)。(6)MRI測(cè)腫瘤體積。(7

15、)直接觀察各組荷瘤鼠的生存期。
　　 結(jié)果：HE染色顯示顱內(nèi)腫瘤形成;GFAP陽(yáng)性。聯(lián)合治療（凍免組）與其他三組比較:腫瘤細(xì)胞凋亡、p21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)顯著增多，PCNA蛋白表達(dá)顯著減少，腫瘤體積縮小，生存期延長(zhǎng)。凋亡細(xì)胞數(shù)與p21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)呈正相關(guān);與PCNA蛋白表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān);p21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)也與PCNA蛋白表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論:凋亡是冷凍、免疫(rhT

16、NF-α)殺傷腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要機(jī)制;冷凍聯(lián)合免疫(rhTNF-α)治療可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng);p21WAF1/CIP1參與了凋亡的調(diào)控;PCNA參與DNA的合成，其下調(diào)反應(yīng)細(xì)胞增殖受抑制，有利于凋亡的發(fā)生，其表達(dá)受p21WAF1/CIP1負(fù)調(diào)控。
　　 第三部分冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療腦膠質(zhì)瘤的臨床觀察
　　 目的:探討冷凍切除聯(lián)合重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-α)治療腦膠質(zhì)瘤的效果。
　　 方法:對(duì)于18例腦

17、膠質(zhì)瘤患者采用冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療。觀察rhTNF-α毒副作用，出院前及以后每6個(gè)月復(fù)查一次MRI評(píng)估治療。
　　 結(jié)果:腫瘤全切除17例，1例次全切除。術(shù)前9例有病例對(duì)側(cè)肢力減退者，均在1周內(nèi)恢復(fù)。rhTNF-α常見(jiàn)的毒副作用為發(fā)熱，局部紅腫及肌肉疼痛發(fā)生率為38.9％(7/18)。術(shù)后隨訪6～20個(gè)月，除1例次全切者術(shù)后15個(gè)月死亡外，余17例均幸存。
　　 結(jié)論:本結(jié)果提示冷凍切除聯(lián)合rhTNF-α治療腦