NOD1-NF-κB對奶牛中性粒細胞機能的調(diào)控作用.pdf

1、中性粒細胞(PMN)功能紊亂是導致圍產(chǎn)期奶牛對乳腺炎病原高度易感的重要原因，但導致圍產(chǎn)期奶牛PMN功能障礙的分子機制遠未闡明。NOD1受體是一類存在于胞漿內(nèi)的模式識別受體，在天然免疫機制中發(fā)揮重要作用。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期期奶牛PMN中NOD1受體表達下調(diào)，但這一改變的臨床意義尚不明確。本研究旨在通過探究NOD1受體功能抑制對大腸桿菌誘導的PMN免疫應答反應的影響，以期揭示NOD1受體表達下調(diào)在圍產(chǎn)期乳腺炎發(fā)病機制中的作用。

2、r>　　實驗一，NOD1/NF-κB信號通路在內(nèi)毒素誘導的中性粒細胞反應中的作用。NOD1受體特異性抑制劑ML130阻斷NOD1信號通路后，采用E.coli粗提物(cLPS)刺激細胞。檢測核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白(pIκBα)及NOD1蛋白的表達變化、PMN細胞促炎性細胞因子分泌能力、吞噬和呼吸爆發(fā)功能、遷移能力、凋亡和自噬功能。結(jié)果:NOD1受體激動劑iE-DAP能夠顯著上調(diào)pIκ Bα蛋白的表達;但這一表達上調(diào)作用卻能夠被ML130所阻斷

3、;同時cLPS誘導的pIκBα蛋白的表達升高也能夠被ML130所阻斷。ML130可顯著抑制cLPS誘導的NOD1蛋白表達;阻斷NOD1/NF-κB信號通路可顯著抑制cLPS誘導的IL-1β、IL-8(P＜0.001)、TNF-α(P＜0.01)、趨化因子CXCL2及CD62LmRNA的表達(P＜0.01);在cLPS刺激下，阻斷NOD1/NF-κB信號通路導致PMN吞噬和呼吸爆發(fā)功能減弱、遷移功能下降、凋亡率及自噬率升高。提示NOD1/

4、NF-κB信號通路在奶牛PMN抗感染免疫機制中發(fā)揮重要作用。
　　實驗二，NOD1/NF-κB信號通路調(diào)控中性粒細胞對E.coli的免疫應答。PMN細胞用NOD1受體特異性抑制劑ML130預孵育2h后，加入E.coli繼續(xù)孵育30min。采用Western blot法檢測NF-κB蛋白表達;采用qPCR法定量檢測炎性因子的表達;采用AnnexinⅤ/PI法檢測細胞凋亡;采用流式細胞術(shù)檢測呼吸爆發(fā)功能;采用透射電鏡法及細菌克隆計數(shù)法

5、觀察PMN吞噬E.coli的功能;采用Bodern小室法檢測細胞遷移能力。結(jié)果:ML130可顯著抑制E.coli誘導的NF-κB蛋白表達(P＜0.001);阻斷NOD1/NF-κB信號通路可顯著抑制E.coli誘導IL-1β、TNF-α、CXCL2和CD62L mRNA的表達(P＜0.01);在E.coli刺激下，阻斷NOD1/NF-κB信號通路導致PMN吞噬（P＜0.05）和呼吸爆發(fā)功能減弱（P＜0.01）、遷移功能下降(P＜0.00