新中藥成分在激光腦損傷保護(hù)及誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、激光致腦損傷是一種特殊類型的腦損傷,激光腦損傷的病理、生理變化特點目前尚不清楚，研究激光腦損傷的特點有重要意義。白藜蘆醇是一種植物提取物，具有抗血小板聚集、抗炎、清除自由基、抗氧化及心血管保護(hù)等多種作用,但白藜蘆醇是否對激光腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用仍不很清楚。海星皂甙-15是我國科學(xué)家自主分離獲得的一種新的中藥成分，它具有多種生物活性作用，包括溶血、抗病毒、抗腫瘤等，可其對膠質(zhì)瘤增殖與分化的影響仍有待探索。本研究擬通過建立一種大鼠激光腦損

2、傷模型，在明確激光腦損傷病理、生理變化的基礎(chǔ)上，初步闡明白藜蘆醇對激光腦損傷的保護(hù)作用機(jī)制；同時，體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，探討海星皂甙-15誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子機(jī)制，為臨床利用新的中藥成分治療激光腦損傷和腦膠質(zhì)瘤提供實驗依據(jù)。
　　第一部分.白藜蘆醇對大鼠激光腦損傷后神經(jīng)保護(hù)作用的研究
　　激光武器是一種利用激光束摧毀飛機(jī)、導(dǎo)彈、衛(wèi)星等目標(biāo)并使其失效的定向能武器，是繼核、電磁脈沖武器之外的另一種高能武器。

3、這種武器產(chǎn)生的激光束具有快速、高能、穿透力極強(qiáng)等特點，可在瞬間穿透目標(biāo)物體，將接觸點汽化或熔解，從而對目標(biāo)物體實現(xiàn)動能或熱能性殺傷。高能激光武器在未來戰(zhàn)爭中的應(yīng)用將會越來越普遍。激光武器對人的視力和肢體造成的損傷已有一些研究報道，但對顱腦損傷的研究則較少，因此，研究激光致顱腦損傷的特點具有重要意義。本研究以大鼠為實驗動物，在建立一種穩(wěn)定、可重復(fù)性激光腦損傷動物模型的基礎(chǔ)上，檢測大鼠激光腦損傷后的病理、生理變化，并探討白藜蘆醇作為激光腦損

4、傷保護(hù)劑的作用，為戰(zhàn)時激光顱腦損傷的救治提供實驗理論依據(jù)。
　　實驗一、大鼠激光腦損傷模型的建立及生理變化
　　目的：建立一種穩(wěn)定、可靠的大鼠激光腦損傷動物模型。方法：成年SD大鼠100只，體質(zhì)量220±30g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=25)和激光腦損傷組(n=75)；激光腦損傷組分別用14J、28J和56J能量激光照射致傷動物，根據(jù)傷后處理時間點每組再分為5個亞組，即傷后6h、24h、48h、72h和7d組，每亞組動物5只；

5、假手術(shù)組不予激光照射。檢測照射后不同時間點動物血壓、脈搏、神經(jīng)功能評分和腦水腫指數(shù)變化。結(jié)果：不同能量組傷后血壓、脈搏、神經(jīng)功能評分和腦水腫指數(shù)變化有所不同；假手術(shù)組則無明顯改變。結(jié)論：工作距離0.5cm、工作電流0.2mA、波長10.64μm的28J能量激光可造成穩(wěn)定的激光腦損傷動物模型。
　　實驗二、大鼠激光腦損傷后的病理變化
　　目的：檢測大鼠激光腦損傷后損傷區(qū)腦組織的病理變化特點，探討激光腦損傷動物模型的特殊標(biāo)記物。

6、方法：成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量220±30g，隨機(jī)分為對照組(n=6)和激光腦損傷組(n=30)；激光腦損傷組用工作距離0.5cm、工作電流0.2mA、波長10.64μm的28J能量激光照射而致傷動物，根據(jù)傷后處理時間點再分為5個亞組，即傷后6h、24h、48h、72h和7d組，每亞組6只動物；對照組不予激光照射。檢測照射后不同時間點傷區(qū)腦組織HE、電鏡病理形態(tài)變化，免疫組化法檢測熱休克蛋白70和小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果：激光照射后

7、不同時間點傷區(qū)腦組織HE染色顯示形態(tài)變化不同；電鏡病理形態(tài)變化主要表現(xiàn)在以血管內(nèi)皮細(xì)胞受損改變?yōu)橹骷把X屏障受損改變；免疫組化顯示熱休克蛋白70表達(dá)不同；OX-42免疫組化顯示小膠質(zhì)細(xì)胞激活的數(shù)量及形態(tài)變化均有異；對照組無明顯改變。結(jié)論：系統(tǒng)檢測大鼠激光腦損傷后病理改變，揭示小膠質(zhì)細(xì)胞可作為大鼠激光腦損傷的標(biāo)記物。
　　實驗三、白藜蘆醇對大鼠激光腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用
　　目的：檢測大鼠激光腦損傷后生化指標(biāo)改變，探討白藜蘆醇的

8、神經(jīng)保護(hù)作用。方法：成年SD大鼠55只，體質(zhì)量220±30g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=5)、激光腦損傷組(n=25)和白藜蘆醇治療組(n=25)；激光腦損傷組和治療組用28J能量激光照射致傷動物，根據(jù)傷后處理時間點每組再分為5個亞組，即傷后6h、24h、48h、72h和7d組，每亞組5只；假手術(shù)組不予激光照射。檢測各組動物在白藜蘆醇處理前后不同時間點神經(jīng)行為學(xué)評分、腦水腫指數(shù)變化；并用氨基酸分析儀檢測多種氨基酸的變化；放射免疫法檢測血清炎

9、性因子的改變；免疫印跡法檢測熱休克蛋白70的表達(dá)。結(jié)果：白藜蘆醇治療組神經(jīng)行為學(xué)評分增加，腦水腫指數(shù)降低，興奮性氨基酸水平下降，熱休克蛋白70表達(dá)增多。結(jié)論：白藜蘆醇可作為大鼠激光腦損傷有效的神經(jīng)保護(hù)劑。
　　第二部分.海星皂甙-15通過線粒體途徑誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞凋亡的實驗研究
　　腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，約占成人顱內(nèi)腫瘤的40％～50％，其惡性度高，侵襲性很強(qiáng)，手術(shù)治療后仍易復(fù)發(fā)；放療和化療雖然也有

10、療效，但患者總的預(yù)后仍無明顯改善。目前,越來越多的學(xué)者開始致力于尋找對膠質(zhì)瘤更有效的化療藥物研究，以期提高膠質(zhì)瘤的治療效果。海星皂甙-15是我國科學(xué)家從我國南海三亞海域面包海星中分離鑒定的、具有生物活性的一系列海星皂甙中的第15個，該化合物分子式為C45H74O22S2Na2,分子量為1076，系統(tǒng)命名：(20R,24S)-6a-O-[3-O-甲基-b-D-吡喃奎諾糖基-(1?2)-b-D-吡喃木塘基-(1?3)-b-D-吡喃葡萄糖基]

11、-5a-膽甾-9(11)-烯-3b,24-二硫酸鈉鹽。已有研究表明它具有多種生物活性，包括溶血、抗病毒、抗腫瘤等，本研究利用人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG細(xì)胞研究海星皂甙-15在體外對腫瘤細(xì)胞的影響，探索其作用機(jī)理，以期為臨床發(fā)現(xiàn)新的、更有效的抗腫瘤化療藥物。
　　目的：探討面包海星提取物海星皂甙-15對人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞的影響及可能作用機(jī)理。方法：體外培養(yǎng)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞，采用MTT實驗檢測海星皂甙-15

12、對U87MG增殖的影響；DNALadder檢測凋亡片段；透射電鏡檢測細(xì)胞和線粒體形態(tài)學(xué)改變；Hoechst33342和Tunel染色檢測細(xì)胞核變化；流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及線粒體跨膜電位(△Ψm)的改變；Westernblot分析細(xì)胞色素C、Caspase-3蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：海星皂甙-15呈時間和劑量依賴性抑制U87MG細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞凋亡，其作用在12h、24h、48h、72h的IC50分別為9.9、

13、5.3、3.8、2.6μg/mL；海星皂甙-15引起線粒體結(jié)構(gòu)損傷，出現(xiàn)線粒體嵴斷裂、△Ψm下降、細(xì)胞色素C釋放增多、Caspase-3蛋白活化。結(jié)論：海星皂甙-15能抑制U87MG細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過線粒體損傷途徑可能是其作用機(jī)理。
　　總結(jié):
　　1、建立一種穩(wěn)定、可重復(fù)的大鼠激光腦損傷動物模型，系統(tǒng)觀測了大鼠激光腦損傷后血壓、脈搏、神經(jīng)行為學(xué)評分及腦水腫改變；透射電子顯微鏡觀察了傷區(qū)腦組織的超微結(jié)構(gòu)改變；免疫組