重組菌絲霉素抗菌肽的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及其在斷奶仔豬上的應(yīng)用效果研究.pdf

1、菌絲霉素是一種從腐生子囊菌中分離出的防御素類抗菌肽，具有抗革蘭氏陽性菌的作用。為實現(xiàn)其廉價生產(chǎn)，本實驗室在前期研究中構(gòu)建了重組菌絲霉素基因工程菌(PPle);為進一步提高其表達水平，本研究利用30L發(fā)酵罐篩選了最適培養(yǎng)基;在此基礎(chǔ)上，評價了重組抗菌肽在斷奶仔豬上的應(yīng)用效果，以期為菌絲霉素抗菌肽在飼料工業(yè)中的推廣應(yīng)用積累資料。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　試驗一:重組菌絲霉素抗菌肽發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及其體外抑菌效果的研究
　　試驗

2、利用30L發(fā)酵罐對工程菌PPle進行液體發(fā)酵，采用分批-補料式發(fā)酵工藝，比較甘油低鹽、甘油基礎(chǔ)鹽和可溶性淀粉基礎(chǔ)鹽三種不同培養(yǎng)基對重組菌絲霉素抗菌肽分泌表達的影響。采用考馬斯亮藍法檢測發(fā)酵上清液總蛋白，通過SDS-PAGE檢測重組抗菌肽的表達形式，結(jié)合平板抑菌試驗考察重組抗菌肽體外穩(wěn)定性和抑菌效果。結(jié)果表明:發(fā)酵到114h，甘油低鹽組、甘油基礎(chǔ)鹽組和可溶性淀粉基礎(chǔ)鹽組菌體濕重達到最高，分別為450g/L，402g/L，277g/L。發(fā)酵

3、114h，測得甘油低鹽組發(fā)酵上清液蛋白總濃度:0.375g/L;甘油基礎(chǔ)鹽組:3.941g/L;可溶性淀粉基礎(chǔ)鹽組:5.63g/L。體外抑菌結(jié)果顯示:通過酸、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理之后，重組菌絲霉素抗菌肽對金黃色葡萄球菌有較強抑菌效果。上述結(jié)果表明:通過優(yōu)化培養(yǎng)基，提高了重組抗菌肽的表達量，且其穩(wěn)定性好，對金黃色葡萄球菌抑菌效果強，最適培養(yǎng)基為甘油基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基。
　　試驗二:重組菌絲霉素抗菌肽在斷奶仔豬上的應(yīng)用效果研究
　　

4、本試驗考察了重組菌絲霉素抗菌肽(Ple)對斷奶仔豬生長性能、免疫功能和腸道健康的影響。試驗選用30頭24日齡健康DLY斷奶仔豬，按體重一致原則分配至5個組:對照組（CON:無抗飼糧），硫酸黏菌素組（CS:飼糧添加0.3％硫酸粘桿菌素），抗菌肽組（AP:飼糧添加0.2％ Ple），微生態(tài)制劑組（PB:飼糧添加0.1％微生態(tài)制劑）和聯(lián)合應(yīng)用組（PPB:0.2％ Ple+0.1％微生態(tài)制劑），試驗期為21d。結(jié)果表明:
　　與對照組相比

5、，CS組和AP組顯著增加了ADFI和ADG，顯著降低了F/G(P＜0.05)，有降低腹瀉率的趨勢（P=0.065），且極顯著降低了腹瀉指數(shù)（P＜0.01），分別降低了91％和88％。與對照組相比，其余四個處理有提高能量和干物質(zhì)表觀消化率的趨勢（P＜0.1）。PB組磷的養(yǎng)分表觀消化率極顯著高于其余四個處理（P＜0.01）。與對照組相比，CS組、AP組和PPB組的十二指腸黏膜麥芽糖酶、蔗糖酶酶活，空腸黏膜麥芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶酶活均得到了

6、顯著提高(P＜0.01)。AP組和PPB組對血清D-木糖的吸收極顯著高于其余三個處理組（P＜0.01）。與其余各組相比，AP組顯著提高了回腸食糜雙歧桿菌的含量（P＜0.05）。PB組回腸食糜乳酸桿菌含量顯著高于對照組（P＜0.05），但與其他處理組差異不顯著。PB組盲腸食糜中大腸桿菌含量顯著高于CS組和AP組(P＜0.05)，其中PPle組最低。與其余各組相比，CS組有降低結(jié)腸食糜微生物中大腸桿菌含量的趨勢（0.01＜P＜0.05）。與

7、對照組相比，AP組、PB組和PPB組極顯著降低了結(jié)腸中食糜的pH值(P＜0.01)。與對照組相比，其余四個處理極顯著增加了十二指腸絨毛長度、絨隱比、空腸絨毛長度和回腸絨毛長度、絨隱比，降低了回腸隱窩深度（P＜0.01）。與對照組相比，CS組、AP組和PPB組極顯著提高了空腸黏膜sIgA分泌水平(P＜0.01)。與其余四個處理相比，對照組極顯著提高了IgG分泌量(P＜0.01)。
　　綜上所述，重組菌絲霉素抗菌肽最適發(fā)酵培養(yǎng)基是甘油