白介素17及趨化因子受體CCR4、CCR6與類風濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究.pdf

1、類風濕性關(guān)節(jié)炎(theumatoid artbritis，RA)是一種主要累及周圍關(guān)節(jié)為主的自身免疫性疾病?，F(xiàn)知RA由多種因素引發(fā)，T細胞在RA的發(fā)病和進展中起關(guān)鍵性作用，近年的研究發(fā)現(xiàn)，類風濕性關(guān)節(jié)炎與機體的免疫功能紊亂密切相關(guān)，多種復(fù)雜的細胞因子參與了類風濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)的破壞和全身紊亂過程。TNF-α和IL-1的抑制物干擾性治療在RA中取得了良好的療效，這充分支持了細胞因子在RA中發(fā)揮著重要作用的觀點。IL-17是由新近被證實的

2、一類不同于Th1和Th2細胞亞群的CD4+輔助性T細胞亞型--Th17細胞(此亞群細胞可產(chǎn)生IL-17、IL-6和TNF-α而不產(chǎn)生IFN-γ和IL-4)產(chǎn)生的促炎性細胞因子，表達在T細胞上，其受體(IL-17R)表達在大多數(shù)細胞和組織上。IL-17是一個促炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，對靶細胞可以產(chǎn)生炎癥誘導作用。IL-17在調(diào)節(jié)免疫和炎癥應(yīng)答，調(diào)節(jié)一些組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和自身免疫疾病的進展中發(fā)揮重要作用。IL-17作為T細胞誘導炎癥的一個重要的

3、活化劑，與TNF-α和IL-1β又有一些共同的生物學特性，IL-17可以抑制RA滑膜和骨Ⅰ型膠原的合成，刺激它的分解，因此在RA發(fā)病機理中可能起到作用。目前對IL-17在RA發(fā)病機制中發(fā)揮作用的研究仍不是很完善。最新的研究顯示，在正常人的外周血和患者的炎癥組織中，記憶/效應(yīng)性Th17細胞出現(xiàn)在CCR6+亞群當中，CCR6+CCR4+T細胞可以特異性產(chǎn)生大量的IL-17，而不產(chǎn)生IFN-γ，同時這些細胞還表達對Th17發(fā)育起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄

4、因子--孤獨受體(RORrt)。目前CCR4和CCR6是否可以作為Th17細胞表面的特征性標志，還有待進一步研究。本實驗擬研究中國RA活動期患者、RA穩(wěn)定期患者、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康人血清中IFN-γ、IL-10、IL-17水平的差異，及外周血CD4+T細胞表面CCR4和CCR6表達水平的差異，以明確IL-17、CCR4、CCR6與RA疾病的相關(guān)性以及IL-17與CCR4和CCR6的相關(guān)性，探討Th17細胞在RA中的作用地位，為尋找

5、以細胞因子為靶點應(yīng)用于RA臨床治療的新策略提供科學依據(jù)。 實驗材料 1、研究對象 選擇本院門診及住院RA患者65例，入選標準：符合1987年美國風濕病協(xié)會修訂的RA診斷標準，并排除有嚴重心腦血管、肝腎疾病和其他自身免疫性疾病，年齡18-60歲，平均41±13歲，其中男20例，女45例，活動期35例，穩(wěn)定期30例作為病例組，判斷活動期的標準為滿足以下5項指標中的3項或3項以上者，包括：①3個或3個以上關(guān)節(jié)腫；②每日

6、＞45min的晨僵；③血沉≥28mm/h；④3個或3個以上關(guān)節(jié)壓痛；⑤雙手平均握力(每只手各測3次，將單手最高值相加除以2為所得值)，男性≦192mmHg，女性≦146mmHg；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)患者35例，入選標準：符合1997年美國風濕病協(xié)會修訂的SLE診斷標準，并排除有嚴重心腦血管、肝腎疾病和其他自身免疫性疾病，年齡18-60歲，平均39±13歲，其中男10例，女25例作

7、為病例對照組；健康對照組為本院健康體檢者50例，年齡18-60歲，平均38±12歲，其中男17例，女33例，血液系統(tǒng)及肝腎功能檢查正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無免疫系統(tǒng)疾病史。SLE組和健康組的年齡、性別與RA組均相匹配。 2、實驗儀器及試劑購自BECTONDICKINSON公司的主要實驗設(shè)備及試劑，包括流式細胞儀(FACS-Aria)；10mlEDTA抗凝管；單克隆抗體：CD3-PerCP、CD4-FITC、C

8、CR6-PE、CCR4-PE-Cy7。IFN-γ、IL-10、IL-17的ELISA定量試劑盒購自R&D公司。其余試劑自行配制：溶血素(KHCO3:1.0g，NH4CL:8.25g，EDTA·Na2:0.037g，Water:1000ml)。 實驗方法 1、血清IFN-γ、IL-10、IL-17水平檢測采集血清標本，使用R&D公司定量試劑盒(ELISA法)對血清IFN-γ、IL-10、IL-17水平進行檢測，酶標儀檢測4

9、50nm處讀OD值，以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，計算IFN-γ、IL-10、IL-17含量。 2、外周血CD4+T細胞表面CCR4和CCR6表達水平的檢測應(yīng)用以下PerCP、FITC、PE、PE-Cy7標記單抗組合對RA患者、SLE患者和健康對照組全血進行分析：CD3/CD4/CCR6/CCR4；另設(shè)1管對照。加入100μl抗凝血，按上述組合依次加入單抗，室溫避光30min。加入溶血素3ml，室溫，1200r/min離心5

10、min，棄上清，洗滌兩次。加入1％多聚甲醛的PBS200μl懸浮，BDFACDiVaTM軟件進行檢測分析。 3、流式細胞儀分析及統(tǒng)計學分析使用前向散射角(FSC)及側(cè)向散射角(SSC)確定淋巴細胞群，以CD3+T淋巴細胞為門，再分別以CD4+T淋巴細胞為門，分析CCR4和CCR6的表達水平。選用SPSS13.0統(tǒng)計學分析軟件。RA活動期患者、RA穩(wěn)定期患者、SLE患者組和健康對照組血清IFN-γ、IL-10、IL-17的水平及C

11、CR4和CCR6的表達水平主要應(yīng)用單向方差分析進行比較，IL-17與CCR4和CCR6的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)檢驗，P<0.05視為具有統(tǒng)計學意義。 實驗結(jié)果 1、RA患者、SLE患者和健康對照組血清中IFN-γ、IL-10、IL-17的表達水平: (1)血清中IFN-γ的表達水平 與健康對照組相比，RA活動期和穩(wěn)定期患者血清中IFN-γ的表達水平均出現(xiàn)有意義的升高(P<0.05)；SLE患者血

12、清中的IFN-γ水平也明顯高于健康對照組(P<0.05)；RA活動期和穩(wěn)定期與SLE組相比，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；RA活動期與穩(wěn)定期相比，無顯著差異(P>0.05)。 (2)血清中IL-10的表達水平 與健康對照組相比，RA活動期和穩(wěn)定期患者血清中IL-10的表達水平都稍有升高，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SLE患者的IL-10水平顯著高于健康對照組(P<0.05)；RA活動期和穩(wěn)定期與SLE組相

13、比，差異均具有顯著性(P<0.05)；RA活動期與穩(wěn)定期相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 (3)血清中IL-17的表達水平 RA活動期患者血清中IL-17的表達水平與SLE患者和健康組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而RA穩(wěn)定期患者與SLE患者和健康組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SLE患者IL-17的表達水平與健康組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)；RA活動期與穩(wěn)定期患者相比，差異顯

14、著(P<0.05)。 2、RA患者、SLE患者和健康對照組外周血CD4+T細胞表面CCR4和CCR6的表達: (1)外周血CD4+T細胞表面CCR4的表達RA活動期患者外周血CD4+T細胞表面CCR4的表達水平與健康組相比，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而與SLE組相比，無顯著性差異(P>0.05)；RA穩(wěn)定期患者與SLE患者和健康組相比，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SLE患者與健康組相比，CCR4的

15、表達水平升高明顯(P<0.05)；RA活動期與穩(wěn)定期相比，差異顯著(P<0.05)。 (2)外周血CD4+T細胞表面CCR6的表達 RA活動期患者外周血CD4+T細胞表面CCR6的表達水平與SLE患者和健康組相比，差異均有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.01)；RA穩(wěn)定期與健康組相比，差異顯著(P<0.05)，而與SLE組相比，無明顯差異(P>0.05)；SLE患者與健康組相比，CCR6的表達水平無明顯變化(P>0.05)；R

16、A活動期與穩(wěn)定期相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 (3)外周血CD4+T細胞表面CCR4+CCR6+T細胞的表達 RA活動期患者外周血CD4+T細胞表面CCR4+CCR6+T的表達水平與SLE組和健康組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；RA穩(wěn)定期與SLE組和健康組相比，無顯著性差異(P>0.05)；SLE患者CCR4+CCR6+T的表達水平與健康組相比，差異無顯著性(P>O.05)；RA活動期與穩(wěn)定期相

17、比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3、RA患者外周血中IL-17與CCR4和CCR6的相關(guān)性比較 RA活動期和穩(wěn)定期患者血清中IL-17的水平與外周血CD4+T細胞CCR4表達的相關(guān)性比較，結(jié)果無明顯的相關(guān)性(P>0.05)，但與CCR6的表達和CD4+CCR4+CCR6+T的數(shù)量呈正相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論： 1、RA活動期和穩(wěn)定期患者血清中IFN-γ的水平均出現(xiàn)有意義的升高，但IL-10的分