山莨菪堿抗休克作用的α7尼古丁受體和β-arrestins抗炎機制.pdf

1、目的：山莨菪堿是中國科學家1965年從茄科植物唐古特莨菪中提取出的生物堿,其人工合成品為654-2。山莨菪堿是托品酸和有機堿形成的酯類,結構與阿托品和東莨菪堿相類似,在托品基的6位炭原子上有不對稱的羥基。山莨菪堿屬于非選擇性的毒蕈堿受體阻斷劑,能夠阻斷M1-M5受體亞型。因此,山莨菪堿有一系列相似于阿托品的藥理作用如抑制唾液分泌、抑制胃酸和汗液分泌,抑制胃腸蠕動及膀胱收縮、散瞳、擴張支氣管。臨床上已經用于由平滑肌痙攣、胃、十二指腸潰瘍、

2、膽道痙攣而引起的疼痛,類風濕性關節(jié)炎,胃潰瘍,急性腎小球腎炎,偏頭痛,過敏性紫癜,肺炎、有機磷酸酯類中毒的解救等多種疾病的治療。自1965年以來,山莨菪堿被用于治療循環(huán)性休克,特別是感染性休克的治療取得了很好的治療效果,如北京友誼醫(yī)院兒科使用山莨菪堿治療爆發(fā)型流行性腦脊髓膜炎,使死亡率從66.9％下降到12.4％,用山莨菪堿治療中毒性細菌性痢疾,使死亡率從20-30％下降到0.5％。目前關于山莨菪堿抗休克的機制主要包括改善微循環(huán)；抑制血

3、栓形成和纖維蛋白溶解作用；穩(wěn)定溶酶體及抑制組織蛋白酶等,但是其相關的分子生物學機制很少報道。 Wang等報道乙酰膽堿與巨嗜細胞上尼古丁受體結合能夠抑制內毒素誘導的炎性因子TNFα,IL-1β,IL-6,IL-18等分泌。進一步研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿的作用主要是通過與巨嗜細胞上的α7尼古丁受體結合,通過細胞內一系列的信號傳遞,最終抑制了Jak2-STAT3和NF-kB信號的激活,從而抑制了炎癥因子的產生。在內毒素休克大鼠模型中,切斷迷走

4、神經能夠明顯加重內毒素誘導的休克反應,動物對內毒素的致死效應更加敏感。直接刺激迷走神經能夠降低內毒素血癥大鼠血漿和組織中TNFα和IL-6的含量,阻止血壓的持續(xù)下降,減緩內毒素引起的低血壓休克的發(fā)生時相。由于乙酰膽堿是迷走神經末梢分泌的主要神經遞質,因此,他們把這條通路命名為膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway)。膽堿能抗炎通路是通過神經來調節(jié)炎癥反應程度的重要通路。山莨菪堿是非選擇

5、性的M受體阻斷劑,因此,我們的第一個假設是：山莨菪堿通過阻斷M受體,使迷走神經分泌的乙酰膽堿更多的與α7尼古丁受體結合激活了膽堿能抗炎通路,發(fā)揮了抗休克作用。β-arrestins是一組多功能的小分子蛋白質,它的經典作用是參與G蛋白偶聯(lián)受體的脫敏。但是近年來的研究發(fā)現(xiàn),β-arrestins作為腳手架蛋白,也參與了許多非G蛋白偶聯(lián)受體激活的信號傳導,如ERK,JNK,p38,Akt和PI3激酶信號通路等,因此β-arrestins也參與

6、了趨化作用,凋亡作用及腫瘤轉移等過程。2006年,Nature上報道了β-arrestins可以和TRAF6結合,負向調節(jié)內毒素休克時的信號傳導通路--TLR-IL-1R(toll-likereceptor-interleuldn-1 receptor)信號通路,最終抑制轉錄因子NF-kB及AP-1的活化,從而抑制炎癥因子的產生。此外,Witherow等報道了β-arrestins,特別是β-arrestin-1能夠直接與NF-kB的抑

7、制因子IKBα結合,使得IKBα-NF-kB復合體滯留在胞漿中,從而阻止NF-kB進入細胞核而抑制其活化。Gao等研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin-2能夠與IkBα結合,抑制IkBα的磷酸化降解,從而抑制NF-kB信號的激活及炎癥因子的表達,并發(fā)現(xiàn)刺激β2腎上腺素能受體能夠加強β-arrestin2-IkBα復合體的穩(wěn)定,從而為交感系統(tǒng)的抗炎作用提供了理論依據。Luan等的研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin-2能夠與IkBα結合,抑制紫外線照射引

8、發(fā)的NF-kB信號活化。阮等的研究發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內皮細胞,山莨菪堿能夠抑制內毒素誘導的內皮細胞活化,山莨菪堿也能夠完全阻斷內毒素誘導的NF-kB活化。因此,我們的第二個假設是：山莨菪堿增加了β-arrestins蛋白的表達,β-arrestins蛋白表達增加抑制了NF-kB信號的活化,參與了與山莨菪堿的抗休克作用。 方法：本研究以內毒素誘導的休克為模型,研究了α7尼古丁受體阻斷劑甲基牛扁堿對山莨菪堿抗休克作用的影響；在受體結合實

9、驗中,利用激光共聚焦觀察了山莨菪堿對乙酰膽堿與α7尼古丁受體結合的影響；在內毒素誘導的RAW264.7巨嗜細胞,利用分子生物學技術研究了山莨菪堿對RAW264.7巨嗜細胞β-arrestin-1蛋白表達的影響及β-arrestin-1蛋白在山莨菪堿抗休克中的作用。 結果： 第一部分：山莨菪堿通過激活膽堿能抗炎通路發(fā)揮了抗休克作用 1、α7尼古丁受體特異性阻斷劑甲基牛扁堿顯著地阻斷了山莨菪堿對大鼠內毒素休克低血壓的

10、改善作用,同時也阻斷了山莨菪堿降低內毒素休克大鼠血清和肝臟炎性細胞因子TNFα和IL-1β水平的作用；甲基牛扁堿也能顯著地阻斷山莨菪堿改善內毒素休克小鼠存活率的作用；在單側迷走神經切斷的小鼠模型上,山莨菪堿的抗休克作用下降；α7尼古丁受體基因敲除的小鼠與其野生對照小鼠相比,山莨菪堿降低內毒素休克小鼠血清中TNFα和IL-1β的作用顯著下降。這些結果說明α7尼古丁受體參與了山莨菪堿的抗休克作用。 2、受體結合實驗結果說明,在RAW

11、264.7巨嗜細胞,山莨菪堿能夠通過阻斷M受體,增加乙酰膽堿與α7尼古丁受體結合的數量；以α7尼古丁受體基因敲除小鼠和其野生對照小鼠的腹腔巨嗜細胞為模型,發(fā)現(xiàn)在野生小鼠的腹腔巨嗜細胞,山莨菪堿能夠加強乙酰膽堿抑制內毒素誘導TNFα分泌的作用,但是在α7尼古丁受體基因敲除小鼠的腹腔巨嗜細胞,山莨菪堿則沒有此作用。 第二部分：山莨菪堿通過增加β-arrestin-1蛋白的表達發(fā)揮了抗休克作用 1、在培養(yǎng)的RAW264.7巨嗜

12、細胞,山莨菪堿能夠劑量和時間依賴性地上調β-arrestin-1蛋白和mRNA表達；山莨菪堿的這個作用能夠被蛋白質合成抑制劑放線菌酮和防線菌素D阻斷；山莨菪堿也能夠顯著的逆轉由內毒素引起的細胞內cAMP含量下降；用cAMP-PKA信號通路的特異性阻斷劑H-89預處理細胞后,發(fā)現(xiàn)山莨菪堿上調β-arrestin-1的作用被阻斷；以內毒素誘導的休克小鼠為模型,山莨菪堿能夠顯著增加脾臟β-arrestin-1的表達。 2、在β-arr