喜樹堿和順鉑上調(diào)多藥耐藥蛋白ABCG2和MRP2以及尼古丁抗炎通路的機制研究.pdf

1、化療在肺癌的綜合治療中具有重要地位，但導(dǎo)致療效欠佳的一個重要原因是多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的形成。為研究化療所誘導(dǎo)的肺癌細胞產(chǎn)生MDR的機制，本課題以人肺癌細胞系NCI-H446細胞為肺癌模型，分別予以不同濃度的喜樹堿和順鉑刺激，先以Annexin V-FITC/PI、羅丹明123和鈣黃綠素AM染色流式細胞術(shù)檢測化療藥誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡、線粒體膜電位變化及細胞活力;次以免疫印跡法檢測多藥耐藥蛋白ABCG

2、2、MRP2和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達變化情況;繼以核質(zhì)分離結(jié)合免疫印跡法和免疫熒光激光共聚焦技術(shù)檢測化療藥對耐藥相關(guān)細胞信號通路ATM、NF-κB的激活情況;最后結(jié)合ATM和NF-κB通路抑制劑CGK733和BAY11-708阻遏相關(guān)激酶活性，以免疫印跡法探究喜樹堿和順鉑上調(diào)多藥耐藥蛋白ABCG2、MRP2和抗凋亡蛋白Bcl-2的分子機制。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn):首先，低劑量喜樹堿和順鉑(0.5μg/ml)在不引起肺癌細胞NCI-

3、H446明顯凋亡的前提下，可明顯改變NCI-H446細胞線粒體膜電位并上調(diào)多藥耐藥蛋白ABCG2、MRP2和抗凋亡蛋白Bcl-2表達;其次，低劑量喜樹堿和順鉑可有效激活A(yù)TM信號通路，并上調(diào)細胞質(zhì)內(nèi)p65和IκBα的磷酸化水平進而促進p65的核轉(zhuǎn)位;再次，ATM磷酸化激酶抑制劑CGK733能有效抑制喜樹堿誘導(dǎo)的細胞質(zhì)內(nèi)p65和IκBα的磷酸化水平及細胞核內(nèi)p65的表達;最后，ATM和NF-κB信號通路抑制劑CGK733和BAY11-70

4、8均能有效抑制由喜樹堿所誘導(dǎo)的ABCG2、MRP2和Bcl-2上調(diào)。上述結(jié)果提示，喜樹堿和順鉑可通過激活肺癌細胞NCI-H446中ATM/NF-κB信號通路上調(diào)多藥耐藥蛋白ABCG2、MRP2等來啟動MDR機制以保護自身免遭化療藥物的殺傷，ATM將可能成為阻止喜樹堿和順鉑所誘導(dǎo)的肺癌多藥耐藥形成的潛在靶點。
　　 急性損傷可導(dǎo)致機體產(chǎn)生免疫應(yīng)激而引起促炎介質(zhì)大量釋放并威脅重要臟器的功能，糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑通過抑制過強的免疫應(yīng)

5、激而成為SARS等疾病早期治療的利器?！澳憠A能抗炎通路”是新近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)通路，對預(yù)防和拮抗過度的炎癥反應(yīng)具有重要作用。尼古丁，作為一種膽堿能受體激動劑，可有效抑制免疫過激所致的促炎因子的釋放。但迄今為止，尼古丁抗炎通路的分子機制尚不清楚。TIPE2是最近發(fā)現(xiàn)的一種免疫負調(diào)節(jié)分子，屬于TNFAIP8家族，對于維持體內(nèi)免疫平衡具重要作用。Stat3是炎癥反應(yīng)的負調(diào)控因子，在細胞因子信號傳遞中起著主導(dǎo)作用，但TIPE2與Stat3在

6、尼古丁介導(dǎo)的抗炎通路中的可能作用及機制有待深入研究。
　　 本課題首先以Western blot檢測尼古丁對Erk1/2、PI3K/Akt和Jak2/Stat3信號通路的激活情況;其次，先以相關(guān)信號激酶抑制劑阻遏激酶活性，再給予尼古丁刺激，以Western blot探討尼古丁調(diào)控TIPE2表達的分子機制;再次，分別以Western blot、流式細胞術(shù)胞內(nèi)染色檢測TIPE2過表達對LPS所致的NF-κB通路激活及炎癥因子IL-1

7、β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α釋放的影響;接著，以Stat3激酶抑制劑AG490阻遏其激酶活性，再給予尼古丁刺激，以免疫印跡法和免疫熒光激光共聚焦技術(shù)探究Stat3在尼古丁調(diào)控NF-κB活性中的作用;最后，以免疫共沉淀法檢測尼古丁刺激對Stat3與NF-κB p65的結(jié)合情況，從而初步闡明尼古丁通過NF-κB通路調(diào)控炎癥反應(yīng)的機制。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn):首先，1μM尼古丁刺激Raw264.7細胞5 min后可激活Ja

8、k2、Erk1/2和PI3K/Akt通路，3hrs后可激活Stat3通路;其次，Erk1/2抑制劑U0126、Mek抑制劑PD98059、PI3K抑制劑Wortmannin和Akt抑制劑LY294002均能明顯抑制尼古丁對TIPE2的上調(diào)作用，其中U0126、PD98059、LY294002抑制作用最為明顯;再次，LPS刺激后15、30 min，TIPE2過表達可使IKKα/β的磷酸化水平明顯低于空載細胞;第四，TIPE2過表達可抑制L

9、PS所致的IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的釋放，其抑制率分別為12.5％、12.5％、25％、12.5％和14.3％;第五，在LPS刺激的條件下，尼古丁預(yù)處理可明顯增加胞質(zhì)中的p65，而以AG490阻遏Stat3磷酸化可降低尼古丁所上調(diào)的胞質(zhì)中p65;細胞核p65檢測結(jié)果則與細胞質(zhì)結(jié)果呈負相關(guān);最后，免疫共沉淀結(jié)果顯示，尼古丁預(yù)處理增強p65與p-Stat3的結(jié)合。
　　 通過以上研究，我們發(fā)現(xiàn)尼古丁可通