液態(tài)藥物載藥法制備10-羥基喜樹堿白蛋白納米粒以及其初步體內(nèi)外評價.pdf

1、背景:白蛋白納米給藥系統(tǒng)（Albumin nano drug delivery system，ANPs-DDS）是以白蛋白為基質(zhì)材料制備的納米制劑，具有很多優(yōu)良的特性。例如一類材料人血白蛋白(Huma serum albumin,HSA)，其屬于內(nèi)源性物質(zhì)，其具有無毒、無免疫源性、生物可降解和生物相容性高的特點。同時在體內(nèi)很多藥物都具有與血漿蛋白結合的能力，因此白蛋白為天然的理想藥物載體。結合日趨受到關注的納米給藥(Nano drug

2、deliverysystem,NDDS)系統(tǒng)的發(fā)展，制備以人血白蛋白為基質(zhì)的納米粒(Huma serum albuminnanoparticles，HSA-NPs)以及給藥系統(tǒng)已受到多方重視。隨著American Bioscience的專利產(chǎn)品人血白蛋白納米粒紫杉醇制劑Abraxane(R)的上市，白蛋白納米制劑已成為新型納米制劑的代表，具有巨大的市場潛力。
　　喜樹堿(camptothecin，CPT)類藥物是天然植物喜樹科當中

3、提取的具有抗癌活性的化學成分，其主要靶向抑制癌細胞核當中的拓撲異構酶-Ⅰ。防止癌細胞的拓撲異構酶-Ⅰ對癌細胞DNA單鏈異構的作用，阻礙DNA的復制與合成，從而達到抑制癌細胞生長的作用。10-羥基喜樹堿（10-hydroxycamptothecin，HCPT）是喜樹堿的10位羥基衍生物，較CPT而言，針對臨床上的胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌具有較好的抗癌活性。但由于喜樹堿類藥物本身的理化性質(zhì)不理想，不溶于水，在生理及堿性條件下易由高

4、治療活性的內(nèi)酯環(huán)開環(huán)形成高毒性而低治療作用的羧酸形式。因此傳統(tǒng)的注射液(pH值為10的液體注射液)并沒有較好的臨床療效。進而影響了該藥物的廣泛應用。通過新型納米藥物制劑技術的發(fā)展，這一問題逐步得到解決，其中發(fā)展了納米晶體、脂質(zhì)體、微乳等劑型。人血白蛋白納米制劑也同樣得到重視，目前雖然大量的文獻已報道HCPT類藥物的白蛋白納米制劑，但由于羥基喜樹堿在二氯甲烷、氯仿和豆油等有機相中溶解度不高，并不適用于現(xiàn)有廣泛應用的乳化法和Nab-tech

5、nology載藥法。現(xiàn)有方法存在載藥效率低、毒性試劑的引入（有機相和毒性交聯(lián)劑等）等問題，因此該藥物制備成為白蛋白載藥納米粒仍存在技術壁壘。
　　目的:為克服載藥效率低和毒性試劑引入等問題以及探索創(chuàng)新型載藥方式。本研究開展了以內(nèi)源性還原態(tài)谷胱甘肽(Reduced-glutathione，r-GSH)為交聯(lián)劑制備的空白HSA-NPs并結合低分子量聚乙二醇（Low weight polyethylene glycol，1-PEG）HC

6、PT復合物載藥法首次實現(xiàn)干燥條件下載藥的研究，具有一定的創(chuàng)新性。該方法通過1-PEG與目標分子HCPT形成廣泛的氫鍵作用，進而提高該藥物在其中的溶解度，形成高含量的HCPT液態(tài)藥物復合物，結合該復合物的特殊性質(zhì)開展載藥研究。
　　方法:為成功制備以人血白蛋白為載體的10-羥基喜樹堿納米粒(HCPT-HSA-NPs)，本課題首先針對r-GSH制備空白HSA-NPs并進行條件優(yōu)化和探索。對蛋白液濃度、乙醇比例和制備流程進行優(yōu)化，成功制

7、備粒徑小于200nm，性質(zhì)穩(wěn)定的空白HSA-NPs。接下來本研究針對1-PEG與HCPT復合物制備的參數(shù)進行考察和研究，得到穩(wěn)定的1-PEG-HCPT，該復合物具有較高的HCPT濃度(80mg/ml)并具有遇水極易析出的特性。進而開展1-PEG-HCPT復合物在干燥條件下與HSA-NPs凍干粉末混合載藥工藝的初步研究，得出基本載藥步驟:(1)經(jīng)凝聚法制備以還原性谷胱甘肽為交聯(lián)劑的HSA-NPs，并進行凍干處理。(2)利用乙醇為溶媒將HC

8、PT與1-PEG在低壓旋轉蒸發(fā)條件下制備1-PEG-HCP。(3)在干燥條件下將HSA-NPs凍干粉末與液態(tài)藥物復1-PEG-HCP進行充分攪拌、擠壓混合。(4)再將該混合物重新分散至水環(huán)境中得到較理想的HCPT-HSA-NPs。
　　對制備得到的樣品進行體內(nèi)、體外表征評價，深入闡述和解釋該載藥方法的機理和可行性。通過體外表征的項目如:粒徑、分布、Zeta電位、含量、復合物性質(zhì)考察、形態(tài)觀察、釋放速率測定、穩(wěn)定性考察、溶液物理穩(wěn)定

9、性考察、X-ray粉末衍射(X-ray powderdiffraction，XRD)示差掃描量熱法（Differential scanning calorimetry, DSC）等方法證明HCPT與HSA-NPs結合的方式以及載藥原理。并通過體外細胞毒性實驗和體內(nèi)藥效學實驗、體內(nèi)分布實驗進一步對比HCPT-HSA-NPs與傳統(tǒng)HCPT注射液的體內(nèi)、外行為，以證明該制備方法的可行性。
　　結果:證明制備的HCPT-HSA-NPs符合

10、納米制劑的形態(tài)學和體積要求，經(jīng)液態(tài)藥物復合物法制備的納米粒具有高包封率（Entrapment efficiency, EE）（平均高于99％），平均粒徑低于200nm，含量可達7％;制備過程引入試劑毒性較小（乙醇、谷胱甘肽、低分子量聚乙二醇）;多分散系數(shù)（Polydispersity index，PDI）結果證明該納米制劑分布較窄。Zeta電位符合溶液穩(wěn)定性要求。該HCPT-HSA-NPs具有體外緩釋作用，釋放周期達100小時。溶液物理

11、穩(wěn)定性實驗提供了載藥機制的可行性的證據(jù)并證明了HSA-NPs的載體功能。同時XRD和DSC結果證明1-PEG-HCPT可以成功的將HCPT遞送到HSA-NPs的空間網(wǎng)狀結構中。各結果系統(tǒng)的證明了利用液態(tài)HCPT復合物載藥法依據(jù)1-PEG-HCPT高含量和遇水極易析出的性質(zhì)所制定的載藥策略的可行性。同時制備得到的HCPT-HSA-NPs在細胞毒試驗、異種瘤移植抑制實驗和藥物體內(nèi)分布等體內(nèi)實驗中得到印證。體內(nèi)體外結果表明該方法可以成功將HC

12、PT包載到人血白蛋白納米上并在體內(nèi)發(fā)揮作用，細胞毒性實驗證明HCPT-HSA-NPs較HCPT注射劑具有顯著提升，體內(nèi)抑瘤效果顯著高于傳統(tǒng)注射制劑(傳統(tǒng)注射劑為21.45％，HCPT-HSA-NPs為40.63％，p＜0.01)等優(yōu)勢。
　　結論:同時與現(xiàn)有HCPT白蛋白納米粒制備方便相比較，具有一定的優(yōu)勢。其相對于傳統(tǒng)的乳化法、pH調(diào)節(jié)沉淀法等具有較低的毒性試劑引入、較高的包封率以及較少的投料比例。同時該方法為解決類似HCPT理