羥基喜樹(shù)堿長(zhǎng)循環(huán)納米粒及其兩親性載體的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 隨著上世紀(jì)70年代,Birrenbach等首次提出納米粒的概念和制備方法,藥物制劑的研究進(jìn)入了一個(gè)全新的微觀領(lǐng)域--納米制劑。與常規(guī)藥物相比,納米藥物具有比表面積大、表面反應(yīng)活性高、活性中心多、吸附能力強(qiáng)等特性,還可以改變藥物在體內(nèi)的分布,增加藥物在靶器官的分布量,從而提高療效。但普通納米制劑靜注后,血漿中的多種成分(如載脂蛋白、補(bǔ)體C蛋白等)會(huì)吸附于納米粒的表面,使其易于被吞噬細(xì)胞識(shí)別,即機(jī)體的調(diào)理過(guò)程

2、(opsonization),被單核巨噬細(xì)胞吞噬系統(tǒng)(mononuclear phagocyte system,MPS)吞噬并迅速?gòu)难褐星宄Ｒ蚨绾伪苊釳PS對(duì)納米粒的識(shí)別和吞噬是其能否被傳輸至其他器官或組織的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)納米粒的表面特性如親脂性強(qiáng)弱、表面電位值等與調(diào)理素蛋白在其表面的吸附息息相關(guān)。一般來(lái)說(shuō)納米粒的表面親脂性越強(qiáng)、表面電位值越低,調(diào)理素蛋白越容易吸附。由此可見(jiàn)納米粒的表面特性對(duì)制備長(zhǎng)循環(huán)納米粒極為重要。目前針對(duì)納米

3、粒表面改性的研究主要集中在兩個(gè)方面:(1)在納米粒的表面包被親水性的聚合物或表面活性劑；(2)制備含親水性片斷的兩親性高分子載體材料,這些材料含有PEG、PEO、poloxamer、poloxamine、Polysorbate-80及Briji-35等。其共同點(diǎn)是能在納米粒親脂性內(nèi)核的表面形成水化保護(hù)層(protective clouds)并具備一定的立體位阻效應(yīng),能抑制調(diào)理素蛋白在納米粒表面的吸附,即所制備的納米粒具有“隱形”(ste

4、alths)特性,從而使得納米粒不易被MPS識(shí)別,達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)目的。
　　 包被有poloxamer等表面活性劑的納米粒雖具備長(zhǎng)循環(huán)的特質(zhì),但在體內(nèi)微環(huán)境中,有學(xué)者認(rèn)為血液中物質(zhì)和包衣層物質(zhì)間范德華力的存在容易引起包被層在體內(nèi)循環(huán)中脫落,脫落的外源性物質(zhì)作為一種外來(lái)性抗原對(duì)人體可能產(chǎn)生的潛在毒副作用值得關(guān)注并仍存在爭(zhēng)議；在兩親性高分子載體合成方面,目前文獻(xiàn)報(bào)道的共聚物幾乎均為AB型或者ABA型,其中包含有親水性的片段如PEG、PE

5、O等,具體的載體材料有PEG-PLGA、PEG-PLA及PEG-PHDCA等。其制備多是將PEG或單甲基取代的PEG分子、PEO等與乳酸分子單體或氰基烷酸酯等單體聚合反應(yīng)而成,其反應(yīng)條件要求苛刻如要求惰性氣體保護(hù)、反應(yīng)管需融封、添加引發(fā)劑等。
　　 本課題直接選用適宜分子量的PEG和PCL為原料,琥珀酸酐為橋聯(lián)劑,制備含不同重復(fù)單元數(shù)量的PEG和PCL的兩親性共聚物載體材料。其中PCL為半結(jié)晶狀的高分子材料,選用它作為兩親性共聚

6、物載體的親脂性部分,既可以作為親脂性藥物的儲(chǔ)庫(kù),其所含有的晶狀結(jié)構(gòu)又有利于保持納米粒形態(tài)的穩(wěn)定。PCL應(yīng)用歷史悠久,如將其作為長(zhǎng)效避孕藥體內(nèi)埋植劑的載體材料、組織工程材料等；PEG安全無(wú)毒,已被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。本課題所選用的制備方法具有反應(yīng)條件溫和、簡(jiǎn)便易行和反應(yīng)收率高等優(yōu)點(diǎn)。
　　 羥基喜樹(shù)堿(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是從珙桐科植物喜樹(shù)中提取的一種微量生物堿,是拓?fù)洚悩?gòu)酶I的特異性抑制劑,

7、廣泛應(yīng)用于肝癌、胃癌、白血病等多種惡性腫瘤的治療。但其特殊的理化性質(zhì):水不溶脂難溶、內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等因素,限制了臨床應(yīng)用,普遍存在療效降低、半衰期短的缺點(diǎn)。本研究以HCPT為模型藥物,以兩親性的PEG-PCL多嵌段共聚物為載體材料,制備長(zhǎng)循環(huán)納米粒(long-circulating nanoparticles),同時(shí)以脂質(zhì)材料包裹的羥基喜樹(shù)堿半固體脂質(zhì)納米粒制劑為對(duì)照組,通過(guò)體外釋放和大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)比較二者的長(zhǎng)循環(huán)能力之間的差

8、異,旨在尋求一種新型的長(zhǎng)循環(huán)制劑載體材料和制備HCPT長(zhǎng)循環(huán)納米制劑。
　　 材料與方法
　　 1 HCPT-SSLN的制備與表征
　　 選擇固態(tài)和液態(tài)脂質(zhì)為膜材,大豆磷脂為表面活性劑,采用乳化蒸發(fā).低溫固化法制備了羥基喜樹(shù)堿半固體脂質(zhì)納米粒(HCPT-SSLN)。以納米粒的外觀、粒徑、包封率為指標(biāo),分別考察了表面活性劑種類(lèi)、固態(tài)脂質(zhì)/液態(tài)脂質(zhì)摩爾比、藥脂比、表面活性劑濃度、乳化蒸發(fā)攪拌時(shí)間、攪拌速度等因素對(duì)制備

9、的影響；在此基礎(chǔ)上,選定藥脂比、固態(tài)脂質(zhì)與液態(tài)脂質(zhì)的摩爾比、表面活性劑濃度為3個(gè)因素,進(jìn)行3因素3水平正交設(shè)計(jì)優(yōu)選處方。用Malvern激光粒度儀測(cè)定HCPT-SSLN的表面電位、粒徑及粒徑分布；透射電鏡觀察HCPT-SSLN的形態(tài)；建立了414nm處紫外分光光度法測(cè)定開(kāi)環(huán)形式HCPT含量的方法,用葡聚糖凝膠柱層析-UV法測(cè)定HCPT-SSLN的包封率和載藥量。探討了不同冷凍保護(hù)劑對(duì)凍干HCPT-SSLN的影響,并對(duì)凍干制劑進(jìn)行了穩(wěn)定性

10、考察。以HCPT鈉鹽注射液作對(duì)比,選用昆明種小白鼠考察所制備的HCPT-SSLN的急性毒性。
　　 2 多嵌段PEG-PCL共聚物的合成研究
　　 選用適宜分子量的PEG和PCL為起始原料,琥珀酸酐為橋聯(lián)劑,合成多嵌段的PEG-PCL兩親性共聚物載體,并用FT-IR、1H-NMR、GPC、DSC、XRD分析對(duì)其進(jìn)行表征；選用L969細(xì)胞株,以MTT和乳酸脫氫酶(LDH)活性指標(biāo)考察所合成共聚物的生物相容性。
　　

11、 3 HCPT-PEG-PCL-NPs的制備與表征
　　 以共聚物為載體材料,Span60和Poloxamer 188為乳化劑和穩(wěn)定劑,用共溶劑揮發(fā)法制備了羥基喜樹(shù)堿兩親性嵌段共聚物納米粒(HCPT-PEG-PCL-NPs)。以納米粒的外觀形態(tài)、粒徑、包封率、載藥量為指標(biāo),考察了Span/PEG-PCL的摩爾比、投藥量、Span/Poloxamer的摩爾比、攪拌速率、攪拌溫度、水相用量、水化時(shí)間等因素對(duì)制備的影響；在此基礎(chǔ)上,選

12、定PEG-PCL種類(lèi)、投藥量、Span/Poloxamer的摩爾比、Span/PEG-PCL的摩爾比為4個(gè)因素,進(jìn)行4因素3水平正交設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝。用Malvern激光粒度儀測(cè)定HCPT-SSLN的表面電位、粒徑及粒徑分布；透射電鏡觀察HCPT-SSLN的形態(tài)；建立了384nm處內(nèi)酯形式存在的HCPT體外HPLC分析方法,用超濾離心-HPLC法測(cè)定HCPT-PEG-PCL-NPs的包封率和載藥量。探討了不同冷凍保護(hù)劑對(duì)凍干HCPT-PEG

13、-PCL-NPs的影響,并對(duì)凍干制劑進(jìn)行了XRD分析和初步的穩(wěn)定性考察。
　　 4 HCPT-NPs的體外釋放研究
　　 采用動(dòng)態(tài)透析法,以pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液為釋藥介質(zhì),HCPT原料藥的水溶液為對(duì)照組,37℃恒溫避光恒速(100r/min)攪拌下進(jìn)行HCPT-SSLN和HCPT-PEG-PCL-NPs的體外釋藥實(shí)驗(yàn)。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)上取樣測(cè)定其中的HCPT含量,計(jì)算累計(jì)釋藥量；采用不同的數(shù)學(xué)模型對(duì)不同納米制劑的體外

14、釋藥曲線進(jìn)行擬合,探討其可能的釋藥機(jī)制。
　　 5 HCPT-NPs大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　 設(shè)定HCPT普通水針劑、HCPT-SSLN及4種兩親性共聚物載體材料制備的HCPT-PEG-PCL-NPs共6組；以54只Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(n=9),給藥劑量均為5mg/kg,經(jīng)尾靜脈單劑量注射給藥后在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)上取血并測(cè)定HCPT的血藥濃度；建立了測(cè)定血漿中HCPT含量的HPLC方法,并繪制血藥濃度-時(shí)間曲線,

15、計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),對(duì)不同的HCPT-NPs的長(zhǎng)循環(huán)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較,優(yōu)選最佳HCPT的長(zhǎng)循環(huán)制劑及載體。
　　 結(jié) 論
　　 本研究所制備的HCPT-NPs均能有效增進(jìn)HCPT在制劑中的溶解度,粒徑、形態(tài)、包封率與載藥量均達(dá)到制劑要求,凍干后復(fù)水性較好,動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)安全。合成的多嵌段PEG-PCL共聚物經(jīng)分析符合目標(biāo)物質(zhì),有著良好的生物相容性。體外釋藥實(shí)驗(yàn)中HCPT-NPs均具有一定的緩釋作用且符合Weibull