羥基喜樹堿半固體脂質(zhì)納米粒制備工藝研究

1、<p>　　羥基喜樹堿半固體脂質(zhì)納米粒制備工藝研究</p><p>　　【摘要】 　　目的制備羥基喜樹堿的半固體脂質(zhì)納米粒(HCPT-SSLN)。方法在單因素考察的基礎上，通過正交設計優(yōu)選處方和制備工藝，并對優(yōu)化條件下制備的HCPT-SSLN納米溶液進行質(zhì)量評價。結果制備的HCPT-SSLN平均粒徑為130.5 nm，多分散系數(shù)為0.18，載藥量為2.51％，包封率為79.19％，ξ電位為-33.1m

2、V；納米溶液4℃下放置6個月，納米粒外觀、粒徑及包封率無明顯變化。結論所制備的HCPT-SSLN包封率和載藥量較高，粒徑分布均勻，穩(wěn)定性良好，為羥基喜樹堿的臨床應用提供了更廣闊的前景。 </p><p>　　【關鍵詞】 羥基喜樹堿； 半固體脂質(zhì)納米粒； 制備工藝</p><p>　　Abstract：ObjectiveTo prepare hydroxycamptothecin semi

3、solid lipid nanoparticles (HCPT-SSLN). MethodsBased on the single-factor experiment, the HCPT-SSLN was prepared by orthogonal design for optimization of formulation and technology. Then the obtained SSLN was evaluated. R

4、esultsThe mean particle size of the prepared HCPT-SSLN was 130.5nm, Polydispersity index(PI) was 0.18, drug loading(DL) was 2.51％, entrapment efficiency(EE) was 79.19％, ξ potential was -33.1mV; Placed at 4℃ for 6 months,

5、 the ap</p><p>　　Key words：Hydroxycamptothecin; Semisolid lipid nanoparticles(SSLN); Preparation</p><p>　　納米粒載藥系統(tǒng)自1976年由Birrenbach首次報道以來，由于其具有可生物降解、低免疫性、有一定靶向性且制劑形式多樣化等優(yōu)點，至今已取得很大發(fā)展［1］。固體脂質(zhì)納米

6、粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是粒徑為50～1000nm的新一代亞微粒給藥系統(tǒng)［2］，它能將藥物包裹于類脂核中而使藥物穩(wěn)定性增加，并具有緩控釋、靶向、低毒等優(yōu)點。羥基喜樹堿(hydroxycamptothecin, HCPT)是拓撲異構酶Ⅰ(TOPO-Ⅰ)抑制劑［3～5］。它抗瘤譜廣，且無交叉耐藥性，目前已作為臨床一線用藥。但因其特殊的理化性質(zhì)：水不溶脂難溶、內(nèi)酯環(huán)結構不穩(wěn)定等因素，使得目前臨床應用受

7、到了限制［6］。本研究在單因素考察的基礎上，通過正交設計優(yōu)選處方和制備工藝，以固體脂質(zhì)和液體脂質(zhì)混合物為載體材料制備HCPT的半固體脂質(zhì)納米粒(semisolid lipid nanoparticles, SSLN)，并對優(yōu)化條件下制備的HCPT-SSLN納米溶液進行了質(zhì)量評價。</p><p>　　1 儀器與試劑</p><p>　　UNICAM UV500紫外分光光度計(英國Th

8、ermo Spectronic公司)；激光粒度儀-3000HS(英國Malvern Instruments Ltd)；冷凍干燥機(LABCONCO FreeZone 12L)；JEM-2010透射電子顯微鏡(TEM)(日本株式電子會社)；TMP-1型電子天平（德國Sartorius公司）。</p><p>　　10-羥基喜樹堿原料藥(含量98％，四川廣漢市生化制品有限公司)；Palmitic acid(十六酸，汕

9、頭市西隴化工廠)；Dynasan 118(三硬脂酸甘油酯，Sasol)；Corn oil(玉米油，Sigma)；注射用大豆卵磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司)；Solutol HS 15(聚乙二醇15羥基硬脂酸醋，BASF)；Cremophor EL(氫化蓖麻油，BASF)；PEG-8-辛酸癸酸甘油酯(GATTEFOSSE)；辛酸/癸酸三甘油酯(浙江蘭溪物美化工有限公司)；泊洛沙姆188(Sigma)；賣澤Myrj 59、芐澤Brij 53(

10、Sigma)，其它試劑均為分析純；雙蒸水用前經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。</p><p><b>　　2 方法</b></p><p>　　2.1 HCPT-SSLN的制備采用乳化蒸發(fā)-冷卻固化法制備HCPT-SSLN。稱取一定量的HCPT、脂質(zhì)、卵磷脂共溶于適量有機溶劑中制得有機相，另稱取適量表面活性劑溶于水中制得水相，在75℃水浴下，將有機相勻速注入水相

11、中，避光恒溫攪拌，揮干有機溶劑并濃縮至一定體積，將此半透明乳液快速分散于適量0℃冰水中繼續(xù)攪拌固化0.5 h，經(jīng)0.8 μm微孔濾膜過濾，即得HCPT-SSLN。以納米粒的外觀、粒徑、包封率為考察指標，分別考察了有機溶劑種類、有機相種類、表面活性劑種類、固態(tài)脂質(zhì)/液態(tài)脂質(zhì)摩爾比、藥脂比、有機溶劑用量、表面活性劑濃度、水相與油相中表面活性劑比例、乳化過程中水相與油相比例、有機相注入水相速度、乳化蒸發(fā)攪拌時間、攪拌速度等單因素的影響。<

12、;/p><p>　　2.2 正交設計優(yōu)化HCPT-SSLN的制備工藝在單因素實驗考察的基礎上，選擇藥脂比(A)、固態(tài)脂質(zhì)與液態(tài)脂質(zhì)的摩爾比(B)、表面活性劑濃度(C)3個因素，每個因素選擇3個水平，按正交設計表L9（34）實驗。以包封率為指標，按正交結果擬定的最佳處方和工藝制備3批樣品，對制得的HCPT-SSLN進行質(zhì)量評價來對優(yōu)化結果進行驗證。</p><p>　　2.3 HCPT-

13、SSLN凍干粉的制備按2 ml/瓶將HCPT-SSLN分裝在7 ml的西林瓶中，每瓶中加入4.0%的乳糖，攪拌使完全溶解，放入冷凍干燥機，按照0.5℃/min降溫至-34℃并維持24 h，在冷凝器低溫、干燥箱保持一定真空度條件下，按照0.07，0.04，0.07℃/min三階段升溫至25℃，保溫10 h，取出樣品，壓蓋處理，即得HCPT-SSLN凍干粉劑。</p><p>　　2.4 HCPT-SSLN納米溶液

14、的質(zhì)量評價</p><p>　　2.4.1 形態(tài)、粒徑分布和ξ電位測定取HCPT-SSLN適量，稀釋，滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，室溫(25℃)下以2.0%的磷鎢酸鈉液負染，透射電鏡下觀察粒徑大小和形態(tài)。</p><p>　　取HCPT-SSLN適量，稀釋，波長633 nm處Malvern激光粒度儀上測定其粒徑和ξ電位。</p><p>　　2.4.2 HC

15、PT的含量測定精密稱定1.0 mg HCPT置50 ml量瓶中，用pH 12.0 NaOH溶液(0.01 mol/L)配制濃度為20 μg·ml-1的溶液作為貯備液。紫外掃描結果表明其最大吸收波長為414 nm，且所有輔料在該波長處的紫外吸收對測定結果無干擾。另取貯備液分別配制濃度為0.2，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg·ml-1的溶液，以其在414 nm處的吸收光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標

16、，得標準曲線方程：A＝0.067 8C+0.001 3(r＝0.999 9)，表明HCPT在0.2～10.0 μg·ml-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好。</p><p>　　樣品處理方法：取1.0 ml HCPT-SSLN用pH 5.0 PBS液稀釋定容至25.0 ml，取其中1.0 ml于試管中，加入一定量的氯仿和pH 12.0 NaOH溶液，渦旋混勻離心，取上清液于414 nm處測定吸收光度。另取pH

17、5.0 PBS液1.0 ml，同法操作得空白對照品。</p><p>　　回收率測定：取HCPT貯備液配制濃度為0.4，4.0，8.0 μg·ml-1的溶液，各取1.0 ml，用pH 12.0 NaOH溶液稀釋到5.0 ml。另取1.0 ml空白納米?；鞈乙?，用pH 5.0 PBS液稀釋定容至25.0 ml。取1.0 ml分別加入上述3種濃度的溶液中，按“2.4.2”項下方法處理后測定，各濃度組重復3次

18、。</p><p>　　2.4.3 包封率(EE)測定包封率(EE)指被包封于納米粒中的藥物含量與投藥總量的比值。精密吸取1.0 ml HCPT-SSLN混懸液上樣于Sephadex G-50柱，以pH5.0PBS液洗脫，洗脫速度為1 ml·min-1，收集乳白色流分，取1.0 ml按“2.4.2”項下方法處理，測定包封在脂質(zhì)體內(nèi)的HCPT濃度C1；另取1.0mlHCPT-SSLN混懸液，加pH5.0

19、PBS液稀釋到25.0 ml，同法測定脂質(zhì)體制劑中的HCPT濃度C2，EE=C1/C2×100%。</p><p>　　2.4.4 載藥量(DL)測定載藥量(Drug Loading Coefficient，DL)系指納米粒中所含藥物量占制劑總量的百分率。即DL=投藥量×EE /HCPT-SSLN凍干粉總量×100％。</p><p>　　2.4.5 穩(wěn)定

20、性考察取適量HCPT-SSLN納米溶液分別置于室溫(25℃)、4℃條件下放置6個月，考察其穩(wěn)定性。觀察項目為外觀、形態(tài)、粒徑及包封率。</p><p>　　2.5 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件處理，±s表示，P&lt;0.05時有顯著性差異。</p><p><b>　　3 結果</b></p><p>　　3.

21、1 單因素考察在文獻調(diào)查及單因素考察的基礎上可知：HCPT是主藥；十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油是基本脂質(zhì)膜材；大豆卵磷脂一有乳化作用，能增加脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性，防止藥物滲漏；二有抗氧化作用，防止HCPT和脂質(zhì)氧化；還有脫模、降低粘度及分散作用等；Solutol HS 15主要作為穩(wěn)定劑和分散劑；丙酮和乙醇有利于溶解各種脂質(zhì)材料，并維持HCPT內(nèi)酯形式；因而最后篩選出來的基本處方組成為：HCPT、十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油、大豆卵磷脂

22、、Solutol HS 15、丙酮和乙醇。</p><p>　　另由考察確定以下參數(shù)：表面活性劑為Solutol HS 15：Soya lecithin為1∶1，有機相溶劑采用12 ml丙酮：6 ml乙醇，水相與油相比為1.5/1，有機相注入水相選定2.0 ml/min的滴速，攪拌速度為800 r/min，乳化蒸發(fā)攪拌時間為2h。此外，固態(tài)脂質(zhì)與液態(tài)脂質(zhì)的摩爾比對包封率影響明顯，2/1時包封率最高，將其范圍定為1

23、/2～4/1；藥脂比對包封率和粒徑影響明顯，1/8時制備工藝不穩(wěn)定，將其范圍定為1/40～1/15；表面活性劑過少則不能制備，過量易引起粒子聚合，故將其濃度范圍定為1.5%～5％；這3個因素仍需進一步考察優(yōu)化。</p><p>　　3.2 正交設計實驗因素和水平見表1，正交設計表及結果見表2，方差分析結果見表3。</p><p>　　表1 因素水平（略）</p><

24、p>　　表2 正交設計HCPT-SSLN的結果（略）</p><p>　　表3 F檢驗的結果（略）</p><p>　　由表2可見，各個因素不同水平對SSLN包封率的影響由大到小依次為：A1＞A3＞A2，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1；R為極差值，RC＞RB＞RA，即表面活性劑濃度對SSLN的包封率影響最大，其次是固態(tài)脂質(zhì)與液態(tài)脂質(zhì)的摩爾比，再次是藥脂比；當表面活性劑濃度為5

25、％時，包封率均在70％以上；而當表面活性劑濃度只有3％時，包封率幾乎都不超過55％；為了保證藥效，包封率是關鍵性指標，故我們選取A1B2C3為最佳處方條件，即藥脂比為1∶20，固態(tài)脂質(zhì)與液態(tài)脂質(zhì)的摩爾比為2∶1，表面活性劑濃度為5％，例如，以投藥量10mg計算，需十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油各66.7mg，大豆卵磷脂和Solutol HS 15各450 mg。</p><p>　　由表3可見只有C因素的F值大于

26、Ｆ0.05(2,2)，說明只有表面活性劑濃度對包封率的影響有統(tǒng)計學意義，為主要影響因素，其次為固態(tài)脂質(zhì)與液態(tài)脂質(zhì)的摩爾比，再次是藥脂比。</p><p>　　經(jīng)驗證，3批樣品平均包封率為81.43％。</p><p>　　3.3 HCPT-SSLN納米溶液的質(zhì)量評價</p><p>　　3.3.1 形態(tài)、粒徑分布測定所制備的HCPT-SSLN混懸液為均一、穩(wěn)

27、定的半透明狀分散系，體系略帶淡藍色乳光。激光散射法測定3批樣品的平均粒徑為（130.5±14.41）nm，多分散系數(shù)為0.18，說明粒徑分布均勻；透射電鏡觀察結果表明，納米粒為圓整的球狀體，無明顯團聚現(xiàn)象。對電鏡所拍攝的粒徑數(shù)據(jù)(N=502)采用SAS軟件進行正態(tài)統(tǒng)計分析，結果粒徑呈非正態(tài)分布，結果見圖1。</p><p>　　圖1 HCPT-SSLN的TEM圖（原放大倍數(shù)：×5 000）（

28、略）</p><p>　　3.3.2 ξ電位測定ξ電位與納米粒體系的穩(wěn)定性密切相關。測定ξ電位可以預測納米粒的儲藏穩(wěn)定性。3批納米粒ξ電位平均為（-33.1±3.30 ）mV，見表4。</p><p>　　表4 HCPT-SSLN的粒徑、ξ電位、包封率和載藥量的測定結果（略）</p><p>　　3.3.3 包封率、載藥量和回收率預實驗表明PB

29、S液(pH＝5.0)能完全洗脫脂質(zhì)體，但對游離HCPT無洗脫能力，故該測定方法可靠。測得包封率為（79.19±2.78）％，RSD為3.51％，載藥量為（2.51±0.17）％，RSD為6.69％（見表4）。平均回收率為（100.31±1.14）％，RSD為1.14％。</p><p>　　3.3.4 pH 3批樣品用pH計測定，pH值分別為6.26，6.29，6.31，平均（

30、6.29±0.023），RSD為0.366％。</p><p>　　3.3.5 凍干粉的水分散性及粒徑分析凍干粉樣品呈現(xiàn)白色疏松塊狀，注射用水及生理鹽水中分散性良好。另取少許粉末，同“2.4.1”項下操作，Malvern測得平均粒徑為（138.9±15.28）nm。</p><p>　　3.3.6 穩(wěn)定性考察HCPT-SSLN納米溶液于室溫(25℃)避光放置6個月

31、后，出現(xiàn)了霉菌、絮狀或膠狀沉淀，黃色藥物結晶析出等現(xiàn)象。4℃條件下避光放置6個月后，無沉淀及藥物結晶析出，為均一、穩(wěn)定的半透明狀分散系，且測得平均粒徑為（141.8±7.84）nm，包封率為（77.29±1.63）％，表明在4℃條件下該制劑的穩(wěn)定性要比常溫下好。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　HCPT的溶解性較

32、差，在正辛醇中的表觀溶解度是其在蒸餾水中的27.2倍，HCPT還能插入磷脂?；溨校幸欢ㄓH和力［7］。其常見臨床用量為5～15mg/d，故以大量脂質(zhì)來包封少量HCPT是可行的。固體脂質(zhì)納米粒的制備方法很多，因為HCPT不溶于水，與磷脂有一定的親和力，當HCPT溶于有機溶媒后與水溶液接觸時，HCPT即大量析出。鑒于此性質(zhì)，采用乳化蒸發(fā)法較好，推測制備原理是使HCPT在高速攪拌過程中進入熔化的脂質(zhì)液滴，插入磷脂雙分子層中而被脂質(zhì)核包封，內(nèi)

33、外水相中的游離藥物有部分吸附在脂質(zhì)核表面，這樣制備的納米粒有較高的包封率，但具體脂質(zhì)與HCPT的作用關系還需進一步研究。</p><p>　　HCPT在液體脂質(zhì)中的溶解度比在固體脂質(zhì)中大，引入液體脂質(zhì)可增大其包封率，因此在固體脂質(zhì)載體中引入Corn oil制備SSLN，液態(tài)脂質(zhì)的加入還能延緩固態(tài)脂質(zhì)由α晶型向β晶型的轉化和減少藥物的滲漏［8］。</p><p>　　本實驗選擇已正式收入歐洲

34、藥典的Solutol HS 15作為水相中的表面活性劑，因為和其他非離子表面活性劑相比，它除了具有更好的增溶穩(wěn)定性，更低的機體代謝毒性，還在體外抗表皮樣癌實驗中表現(xiàn)出明顯的抗多藥耐藥性，被認為是一種潛在的抗腫瘤治療因素［9］，目前被廣泛應用于靜注、口服等多種劑型的輔料。單因素考察結果也說明它能有效增進HCPT的溶解性，增加SSLN包封率和穩(wěn)定性。</p><p>　　通過考察諸多對HCPT-SSLN粒徑和包封率有

35、影響的單因素，本實驗篩選出藥脂比、固態(tài)脂質(zhì)與液態(tài)脂質(zhì)的摩爾比、表面活性劑濃度為制備的3個關鍵要素，并通過正交設計獲得了優(yōu)化工藝和處方，但方差分析結果說明只有表面活性劑濃度對包封率的影響有統(tǒng)計學意義，故還存在對包封率、粒徑影響較大的其它因素，有待進一步研究。</p><p>　　通過質(zhì)量評價，本實驗所制備的HCPT-SSLN包封率和載藥量較高，粒徑分布均勻，穩(wěn)定性良好，為羥基喜樹堿的臨床應用提供了更廣闊的前景。&l

36、t;/p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　?。?］ 楊綺華. 藥物載體系統(tǒng)的研究進展［J］. 中國新藥雜志, 2002, 11(8): 593.</p><p>　　［2］ 王建新, 張志榮. 固體脂質(zhì)納米粒的研究進展［J］. 中國藥學雜志, 2001, 36(2):73.</p><p>　?。?/p>

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