SERPINs對眼部抗新生血管和抗炎的作用及機(jī)制.pdf

1、第一部分:SERPINA3K對大鼠角膜堿燒傷的抗新生血管和抗炎作用
　　 目的:角膜堿燒傷是眼表常見的化學(xué)損傷，其特征是引起眼部新生血管和炎癥的急性反應(yīng)，目前對其病理機(jī)制還不十分明了而且缺乏理想的治療方法，所以一直成為眼科面臨的一個(gè)十分棘手的難題。本論文旨在探討SERPINA3K對堿燒傷后角膜的新生血管和炎癥的治療，并對其中的可能機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 方法:正常成年雄性Wistar大鼠實(shí)施角膜堿燒傷后，正常未堿燒傷的大鼠

2、為陰性對照，實(shí)驗(yàn)分為4組:未進(jìn)行堿燒傷對照組、堿燒傷后PBS處理組、堿燒傷后BSA處理組、堿燒傷后SERPINA3K治療組。每組每只大鼠每天滴眼4次，滴眼劑量為20μg/eye/day，連續(xù)滴眼7天。分別在第1天，第2天，第5天，第8天臨床檢測角膜新生血管面積、炎癥指數(shù)、上皮熒光素鈉染色。組織切片H&E染色觀察角膜病理改變。Western blot檢測角膜新生血管生長因子、色素上皮衍生因子、炎癥因子和表皮生長因子受體即VEGF、PEDF

3、、TNF-α、EGFR的蛋白水平。免疫熒光染色檢測角膜EGFR的表達(dá)。MTT細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)檢測SERPINA3K對HCE和HUVEC細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果:發(fā)現(xiàn)對堿燒傷后的大鼠角膜進(jìn)行SERPINA3K滴眼局部用藥7天，與BSA或者PBS對照組相比，新生血管面積明顯降低。根據(jù)臨床炎癥指數(shù)分析，SERPINA3K組對堿燒傷后角膜炎癥也有抑制作用。SERPINA3K還可增強(qiáng)堿燒傷后角膜上皮的修復(fù)作用。其中的可能機(jī)制與SERPIN

4、A3K可以調(diào)節(jié)促新生血管和抑制新生血管因子的水平，如下調(diào)VEGF，上調(diào)PEDF有關(guān);SERPINA3K還可抑制炎癥因子TNF-α的水平，并可以明顯提高EGFR在角膜上皮的表達(dá)。同時(shí)，SERPINA3K抑制HUVEC細(xì)胞的增殖，但對HCE細(xì)胞的增殖基本沒有影響。
　　 結(jié)論:SERPINA3K對堿燒傷后大鼠角膜新生血管和炎癥有治療作用，并對角膜上皮有促修復(fù)作用。其中的可能機(jī)制與SERPINA3K減低角膜VEGF、TNF-α，上調(diào)P

5、EDF、EGFR因子的表達(dá)有關(guān)。本論文的研究為臨床上治療角膜新生血管提供了新的方向和途徑。
　　 第二部分:SERPINA4對糖尿病視網(wǎng)膜新生血管及炎癥的治療及機(jī)制
　　 目的:最近臨床研究發(fā)現(xiàn)在有糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的玻璃體中，SERPINA4的表達(dá)明顯下降，但在血清中的SERPINA4表達(dá)反而升高。本論文旨在研究高表達(dá)SERPINA4對糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用及其可能的機(jī)制。
　　 方法:建立了C57BL/6N

6、J小鼠在視網(wǎng)膜等多器官高表達(dá)SERPINA4的轉(zhuǎn)基因動物模型。利用OIR模型誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管，檢測視網(wǎng)膜新生血管面積和視網(wǎng)膜新生血管細(xì)胞數(shù)。利用SERPINA4轉(zhuǎn)基因小鼠與糖尿病Akita小鼠雜交產(chǎn)生的Akita xSERPINA4轉(zhuǎn)基因小鼠，檢測了視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮粘附的炎癥細(xì)胞數(shù)和視網(wǎng)膜血管滲漏。利用Wnt報(bào)告基因BAT-gal轉(zhuǎn)基因小鼠與SERPINA4轉(zhuǎn)基因小鼠雜交BAT-gal xSERPINA4轉(zhuǎn)基因小鼠中，檢測了Wnt信號通

7、路在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的變化。Western blot檢測LRP6和non-pi-β-catenin在OIR模型和糖尿病模型視網(wǎng)膜中的表達(dá)，同時(shí)，ELISA檢測VEGF、ICAM-1在以上兩個(gè)模型中的表達(dá)。利用TOPFLASH檢測SERPINA4對Wnt信號通路的調(diào)節(jié)。Western blot檢測SERPINA4對視網(wǎng)膜細(xì)胞的pi-LRP6、LRP6、VEGF、TNF-α表達(dá)的調(diào)節(jié)。免疫共沉淀方法檢測SERPINA4與細(xì)胞膜外端LRP6

8、的特定的結(jié)合。
　　 結(jié)果:在OIR模型中，SERPINA4的高表達(dá)可以明顯的減輕視網(wǎng)膜新生血管面積和新生血管細(xì)胞數(shù)。在SERPINA4轉(zhuǎn)基因小鼠與Akita雜交動物模型中，視網(wǎng)膜血管滲漏、血管內(nèi)皮白細(xì)胞粘附、由于高糖引起的VEGF和ICAM-1的過表達(dá)均明顯降低。SERPINA4的高表達(dá)也抑制由OIR和糖尿病模型引起的Wnt信號通路的激活。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病Wnt報(bào)告基因鼠BAT-gal與SERPINA4轉(zhuǎn)基因鼠雜交動物模型

9、中，SERPINA4可以抑制由于糖尿病引起的視網(wǎng)膜的Wnt信號通路的激活。在離體培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞中，SERPINA4可以阻斷由于高糖和Wnt3a誘導(dǎo)的Wnt信號通路的激活。免疫共沉淀和LRP6的結(jié)合實(shí)驗(yàn)均顯示SERPINA4可以與Wnt的共受體LRP6有高度的特異結(jié)合(Kd=4.5nM)。
　　 結(jié)論:本文以O(shè)IR和Akita為糖尿病視網(wǎng)膜新生血管模型，解釋了SERPINA4作為內(nèi)源性配體抑制Wnt信號通路，并且與LRP6結(jié)合，下