胰島素受體親合短肽的篩選、合成及量子點(diǎn)熒光標(biāo)記的研究.pdf

1、本研究以高效表達(dá)胰島素受體的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)作為篩選靶,利用噬菌體隨機(jī)展示六肽庫篩選胰島素受體親和短肽.經(jīng)四輪篩選,得到六個(gè)ELISA陽性重組克隆,測定其Kd值均為納摩爾級(jí)(5.911nM~26.899nM).Kd值作為篩選成功的主要指標(biāo)能更真實(shí)反映篩選效果.經(jīng)測序得到六個(gè)肽序列,比較發(fā)現(xiàn)明顯的保守序列存在.通過肽自動(dòng)合成儀和手工合成其中五個(gè)小肽,又以肽偶聯(lián)方式將生物素連接在短肽N-末端,得到小肽的生物素化和形式.以質(zhì)譜和EL

2、ISA方法從結(jié)構(gòu)和生物活性兩方面證明以此方法連接的生物素不影響其與親合素的結(jié)合活性.此方法簡化了常規(guī)使用NHS-biotin進(jìn)行短肽生物素化后的繁雜純化過程,而且大大降低了原料花費(fèi).ELISA方法測定并利用PRISM 4.0軟件計(jì)算了這五個(gè)小肽與CHO-IR的Kd值,在5.870 μ M~128.6 μ M之間,屬于特異性結(jié)合范圍.比較其與噬菌體展示短肽與CHO-IR的Kd值的差異,在102-104之間.因?yàn)樵陔膸斓暮Y選和檢測中所用的單

3、抗—多抗系統(tǒng)經(jīng)歷了兩步信號(hào)放大,而且噬菌體展示表位肽附近的氨基酸在空間上可能對(duì)結(jié)合有貢獻(xiàn),由此產(chǎn)生了這種差異.這一比較結(jié)果可以為以后肽庫篩選的取舍提供參考.發(fā)光量子點(diǎn)(luminescent quantum dot)又可稱為半導(dǎo)體納米微晶體(semiconductornanocrystal),是近幾年發(fā)展起來的新材料,是由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米顆粒.作為熒光探針,量子點(diǎn)越來越顯示出它能夠替代傳統(tǒng)的有機(jī)染料優(yōu)越性.量子點(diǎn)具有狹窄

4、對(duì)稱的熒光譜峰(通常20nm~30nm).而且可以根據(jù)量子點(diǎn)的大小和組成材料調(diào)整它的發(fā)射光譜,以CdTe納米晶體合成為例,當(dāng)它的微粒尺寸(直徑)從2.5nm生長到4.0 nm時(shí),它們的光譜即可以從520nm調(diào)整到650nm.量子點(diǎn)具有寬泛的吸收光譜,這樣就能用同一光譜同時(shí)激發(fā)所有顏色的QDs.此外,量子點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)而穩(wěn)定,不易被光漂白,不影響生物分子(抗體、蛋白、細(xì)胞)的生物活性.以上種種都使量子點(diǎn)成為一種新型的潛力巨大的熒光探針,應(yīng)