短C肽門冬胰島素的制備與純化.pdf

1、糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的最重要的疾病之一，胰島素作為治療糖尿病的最常用藥物其研究一直是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點。門冬胰島素是近年來新開發(fā)的胰島素類似物，與傳統(tǒng)的人胰島素相比，門冬胰島素控制血糖的效果顯著，起效快，副作用少，是市場上最常用的速效胰島素藥物。目前關(guān)于門冬胰島素下游純化工藝的報道不多，本文利用富進生物醫(yī)藥有限公司提供的門冬胰島素前體，成功建立了門冬胰島素生產(chǎn)的下游純化工藝，簡化了胰島素生產(chǎn)下游過程的操作步驟，提高了工作效率。

2、r>　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用NiSepharose和SP Sepharose提取純化門冬胰島素前體，去除了發(fā)酵帶來的大部分色素，提高了門冬胰島素前體的純度與濃度。在此基礎(chǔ)上，研究確立了使用Lys-C酶對門冬胰島素前體進行酶切的工藝和條件，一次性去除了門冬胰島素前體的信號肽與C肽，得到了中間體DesB30，并與使用胰蛋白酶對于門冬胰島素前體進行酶切的效果進行了對比。⑵在得到門冬胰島素純化過程中間體DesB30后，研究使用蘇氨酸甲酯與

3、蘇氨酸叔丁酯對于DesB30進行轉(zhuǎn)肽，建立了兩種蘇氨酸酯的轉(zhuǎn)肽條件并進行比較，明確了使用蘇氨酸甲酯進行門冬胰島素轉(zhuǎn)肽的優(yōu)點，并研究了溫度對于門冬胰島素使用蘇氨酸甲酯進行轉(zhuǎn)肽的影響。⑶轉(zhuǎn)肽完成后，使用RP-HPLC對轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物進行純化，研究了幾種反相純化的條件與參數(shù)，并將門冬胰島素酯的純度提高到97%以上。然后，針對門冬胰島素叔丁酯，使用三氟乙酸除去蘇氨酸上的保護基團叔丁基，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的辦法除去三氟乙酸；對門冬胰島素甲酯，研究了不同pH條

4、件對于門冬胰島素甲酯脫保護的影響并確立了脫保護條件，同時研究創(chuàng)立了使用Q Sepharose對于門冬胰島素甲酯的柱上脫保護方法。⑷待門冬胰島素酯脫保護完成轉(zhuǎn)變成成熟的門冬胰島素后，使用RP-HPLC對制得的門冬胰島素進行純化，提高門冬胰島素的純度至98%以上。在RP-HPLC純化主峰的基礎(chǔ)上，研究了pH、鋅的添加比例、氯化鈉以及蛋白濃度對于門冬胰島素結(jié)晶的影響，確立了5 mg/ml門冬胰島素、0.5 mol/L甘氨酸、0.5 mol/L