短C肽門冬胰島素的制備與純化.pdf

1、糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的最重要的疾病之一，胰島素作為治療糖尿病的最常用藥物其研究一直是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)。門冬胰島素是近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的胰島素類似物，與傳統(tǒng)的人胰島素相比，門冬胰島素控制血糖的效果顯著，起效快，副作用少，是市場(chǎng)上最常用的速效胰島素藥物。目前關(guān)于門冬胰島素下游純化工藝的報(bào)道不多，本文利用富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司提供的門冬胰島素前體，成功建立了門冬胰島素生產(chǎn)的下游純化工藝，簡(jiǎn)化了胰島素生產(chǎn)下游過(guò)程的操作步驟，提高了工作效率。

2、r>　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用NiSepharose和SP Sepharose提取純化門冬胰島素前體，去除了發(fā)酵帶來(lái)的大部分色素，提高了門冬胰島素前體的純度與濃度。在此基礎(chǔ)上，研究確立了使用Lys-C酶對(duì)門冬胰島素前體進(jìn)行酶切的工藝和條件，一次性去除了門冬胰島素前體的信號(hào)肽與C肽，得到了中間體DesB30，并與使用胰蛋白酶對(duì)于門冬胰島素前體進(jìn)行酶切的效果進(jìn)行了對(duì)比。⑵在得到門冬胰島素純化過(guò)程中間體DesB30后，研究使用蘇氨酸甲酯與

3、蘇氨酸叔丁酯對(duì)于DesB30進(jìn)行轉(zhuǎn)肽，建立了兩種蘇氨酸酯的轉(zhuǎn)肽條件并進(jìn)行比較，明確了使用蘇氨酸甲酯進(jìn)行門冬胰島素轉(zhuǎn)肽的優(yōu)點(diǎn)，并研究了溫度對(duì)于門冬胰島素使用蘇氨酸甲酯進(jìn)行轉(zhuǎn)肽的影響。⑶轉(zhuǎn)肽完成后，使用RP-HPLC對(duì)轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物進(jìn)行純化，研究了幾種反相純化的條件與參數(shù)，并將門冬胰島素酯的純度提高到97%以上。然后，針對(duì)門冬胰島素叔丁酯，使用三氟乙酸除去蘇氨酸上的保護(hù)基團(tuán)叔丁基，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的辦法除去三氟乙酸；對(duì)門冬胰島素甲酯，研究了不同pH條

4、件對(duì)于門冬胰島素甲酯脫保護(hù)的影響并確立了脫保護(hù)條件，同時(shí)研究創(chuàng)立了使用Q Sepharose對(duì)于門冬胰島素甲酯的柱上脫保護(hù)方法。⑷待門冬胰島素酯脫保護(hù)完成轉(zhuǎn)變成成熟的門冬胰島素后，使用RP-HPLC對(duì)制得的門冬胰島素進(jìn)行純化，提高門冬胰島素的純度至98%以上。在RP-HPLC純化主峰的基礎(chǔ)上，研究了pH、鋅的添加比例、氯化鈉以及蛋白濃度對(duì)于門冬胰島素結(jié)晶的影響，確立了5 mg/ml門冬胰島素、0.5 mol/L甘氨酸、0.5 mol/L