內(nèi)肥素的克隆表達及與其結(jié)合短肽的篩選.pdf

1、內(nèi)肥素(visfatin)是一種新發(fā)現(xiàn)的具有結(jié)合并激活胰島素受體，模擬胰島素作用的肽類激素。內(nèi)肥素有多種生物學(xué)效應(yīng)，在體內(nèi)和體外實驗中具有類胰島素作用，導(dǎo)致其自發(fā)現(xiàn)以來成為內(nèi)分泌研究領(lǐng)域的又一研究熱點。內(nèi)肥素能結(jié)合并激活胰島素受體，但與胰島素在胰島素受體的結(jié)合部位上存在差異。目前其確切生理作用和在胰島素受體上的具體結(jié)合域并不十分清楚，是否存在其自身的特異性受體尚有待于進一步研究。 為獲得大量高純度重組內(nèi)肥素，本實驗首先構(gòu)建內(nèi)肥

2、素的高效表達系統(tǒng)。本實驗采用Trizol法自人大網(wǎng)膜脂肪組織中提取內(nèi)臟脂肪組織總RNA，并以之為模板通過RT-PCR的方法擴增人內(nèi)肥素成熟肽編碼基因。將該基因克隆入pGM-T載體，并進行DNA序列分析。在此基礎(chǔ)上，將編碼人內(nèi)肥素的基因片段克隆到表達載體pQE-30Xa上，并轉(zhuǎn)化入E.coliM15[pREP4]，進行融合表達。目的蛋白含6×His純化標(biāo)簽，可以經(jīng)金屬螯合親和層析吸附于Ni-NTA樹脂層析柱，梯度增加沖洗液中咪唑濃度以除去

3、非特異吸附的雜蛋白后，最終將目的蛋白洗脫，超濾離心法濃縮并初步純化蛋白。隨后經(jīng)Xa因子酶切處理，去除融合標(biāo)簽，將融合標(biāo)簽經(jīng)金屬螯合親和層析吸附于Ni-NTA樹脂層析柱。表達的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot鑒定無誤。蛋白表達條件經(jīng)優(yōu)化后，重組蛋白占菌體總蛋白的42.634％，內(nèi)肥素的表達量達到300mg/L培養(yǎng)基，屬于高效表達，成功構(gòu)建了內(nèi)肥素的高效原核表達系統(tǒng)。目的蛋白只含有內(nèi)肥素成熟肽序列，最終經(jīng)純化后的內(nèi)肥素純度

4、為95.629％。通過蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用測定內(nèi)肥素與胰島素受體的結(jié)合活性，證明實驗得到的表達產(chǎn)物內(nèi)肥素能與胰島素受體結(jié)合，具有生物活性，并具備一定的劑量依賴關(guān)系。 為研究與內(nèi)肥素結(jié)合的多肽序列，將純化后的內(nèi)肥素包被于培養(yǎng)平皿上，通過噬菌體展示技術(shù)對噬菌體隨機七肽文庫進行三輪淘選后，表面展示有與內(nèi)肥素能發(fā)生特異性結(jié)合的多肽序列的噬菌體被富集。富集后的噬菌體最后被洗脫下來，隨機對其中24個陽性克隆進行DNA序列分析，根據(jù)DNA

5、序列分析的結(jié)果，推斷出與內(nèi)肥素特異性結(jié)合的多肽模序。隨后通過ELISA證實，所有經(jīng)淘選獲得的序列均能與內(nèi)肥素發(fā)生特異性結(jié)合，且隨噬菌體滴度的下降，在410nm的吸光度呈一定的梯度下降。根據(jù)對24個噬菌體DNA測序結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)在這些序列中，AAKTPTE、ATTVPAS以及MSLQQEH短肽出現(xiàn)的頻率最高，分別有8個、4個和4個克隆。通過對已測序的結(jié)果進行分析，可以發(fā)現(xiàn)AA(X)TPT(X)這個序列的出現(xiàn)的頻率很高，這個序列很可能就是