microRNA-630對IgA腎病人腭扁桃體TLR4及低糖基化IgA1表達的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）又稱Berger病，1968年由Berger和Hinglais使用免疫熒光技術(shù)對持續(xù)鏡下血尿的患者進行腎活檢時第一次描述，目前IgA腎病已被世界公認為最常見的原發(fā)性腎小球疾病。IgA腎病主要臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿和腎功能進行性損害，超過40％的患者在20年內(nèi)進展為終末期腎病。本病確診需要腎活檢病理檢查，特征性病理表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)沉積IgA1和低糖基化IgA1聚

2、合體形成的免疫復(fù)合物，可伴有IgG和/或IgM及補體成分沉積。
　　國內(nèi)外學(xué)者對IgA腎病的發(fā)病機制進行了較多研究，有學(xué)者認為IgA腎病發(fā)病的病理生理過程經(jīng)歷四個階段:第一步為分泌IgA1的細胞亞群產(chǎn)生低糖基化IgA1增加，第二步為產(chǎn)生針對重鏈可變區(qū)半乳糖基缺陷IgA1的抗多聚糖特異性抗體;第三步為產(chǎn)生的特異性抗體與低糖基化IgA1形成循環(huán)免疫復(fù)合物;第四步為循環(huán)免疫復(fù)合物沉積于腎小球系膜，活化腎小球系膜細胞及補體系統(tǒng)，介導(dǎo)腎小球

3、損傷。由此可見，低糖基化IgA1是IgA腎病發(fā)病的始動因子。
　　近年來，有研究證實IgA腎病發(fā)病與扁桃體粘膜免疫功能紊亂關(guān)系密切。IgA腎病患者腭扁桃體分泌IgA1和J鏈陽性IgA的淋巴細胞增多，產(chǎn)生的低糖基化IgA1與腎小球系膜區(qū)沉積的IgA1高度一致，提示腎小球系膜區(qū)沉積的低糖基化IgA1可能部分來源于扁桃體。我們前期研究發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者行腭扁桃體摘除術(shù)后72小時，血清IgA和IgA1水平顯著增高，尿檢紅細胞和蛋白均增高，

4、可能由于IgA腎病患者在感染、牽拉、擠壓腭扁桃體等刺激情況下，腭扁桃體分泌IgA1細胞產(chǎn)生大量IgA1，進入循環(huán)沉積于腎小球?qū)е履驒z惡化。長期隨訪觀察顯示行腭扁桃體切除術(shù)患者尿檢改善，血尿、蛋白尿得到緩解，血清IgA及IgA1水平顯著降低。此外，一些臨床對照研究也證實IgA腎病患者行腭扁桃體摘除術(shù)后尿檢正常率、腎功能穩(wěn)定率和腎臟存活率均高于未切除組，循環(huán)中IgA水平明顯下降。
　　MicroRNA(miRNA)是真核生物中一類具有

5、內(nèi)源性調(diào)控功能的非編碼RNA，大小19～23bp，通過種子序列(seed sequence)與目標mRNA的3'-UTR區(qū)互補結(jié)合，降解目標mRNA或抑制其蛋白翻譯，對目標基因進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前研究表明miRNA在免疫細胞發(fā)育、活化、炎癥產(chǎn)生及免疫耐受過程中起重要作用。B細胞發(fā)育過程需要miRNAs調(diào)控，敲除Dicer酶的小鼠缺乏B細胞，Dicer酶是miRNA生物合成過程中的關(guān)鍵酶。深度測序技術(shù)（deep sequencing）證實

6、miR-181家族選擇性表達于早期和過渡期B細胞階段，miR-181a抑制促凋亡基因BIM，減少B細胞凋亡;同時發(fā)現(xiàn)miR-146a，miR-155和miR-34a選擇性表達于B細胞，調(diào)節(jié)B細胞分化。這些miRNA參與生發(fā)中心反應(yīng)和記憶B細胞應(yīng)答，其表達下調(diào)能夠改變B細胞穩(wěn)態(tài)，破壞免疫耐受，促進自身抗體的產(chǎn)生。IgA腎病是一種自身免疫性疾病，IgA腎病患者腭扁桃體粘膜免疫處于激活狀態(tài)，我們推測miRNA參與調(diào)控粘膜異常免疫反應(yīng)。

7、　　TLR4是模式識別受體，屬于Toll樣受體家族(TLRs)，表達于多種免疫細胞表面，可識別革蘭陰性細菌脂多糖(LPS)、熱休克蛋白、纖維蛋白原等。TLR4與配體結(jié)合后，活化干擾素調(diào)節(jié)因子IRF-3/IRF-7和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，引起細胞因子、趨化因子、細胞表面粘附分子和共刺激分子產(chǎn)生增加，同時促進固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)。多個研究發(fā)現(xiàn)對IgA腎病患者外周血淋巴細胞加以LPS刺激，檢測β-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶酶（C1GAL

8、T）和COSMC活性降低，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)LPS刺激腭扁桃體單個核細胞后，促進Th0朝向Th1分化，細胞培養(yǎng)上清液IgA1含量明顯增高，提示LPS刺激促進腭扁桃體單個核細胞產(chǎn)生IgA1。LPS/TLR4信號通路活化已被證實對B細胞發(fā)育和分化成熟過程起輔助刺激作用。由此我們推測，IgA腎病患者腭扁桃體可能存在TLR4高表達，通過調(diào)控B細胞的分化和成熟，促進低糖基化IgA1產(chǎn)生。
　　本實驗研究首次采用芯片技術(shù)對IgA腎病患者腭扁桃

9、體miRNA表達譜進行分析，鑒定與非腎病扁桃體炎患者miRNA的差異表達，發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞miR-630表達明顯降低，與IgA1表達及IgA1低糖基化相關(guān)。使用Targetscan、miRanda、PICTA5三個軟件對miRNA-630進行靶基因預(yù)測，DAVID數(shù)據(jù)庫對候選靶基因進行GO(Gene Ontology)功能分析，提示TLR4是miR-630的預(yù)測靶基因，miR-630可能結(jié)合于TLR43'-UTR區(qū)降

10、解TLR4 mRNA或抑制其蛋白翻譯。采用miR-630 mimic轉(zhuǎn)染IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞，模擬細胞miR-630表達上調(diào)，觀察miR-630對TLR4表達、IgA1含量及其糖基化水平的作用，為IgA腎病發(fā)病的粘膜免疫機制提供新的理論依據(jù)。
　　第一章 microRNA-630在IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞的表達及與IgA1低糖基化的相關(guān)性研究
　　目的:探索IgA腎病與非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體組織差異表

11、達的microRNA(miRNA)，檢測腭扁桃體單個核細胞miR-630的表達，IgA1的分泌情況及其鉸鏈區(qū)糖基化水平，分析miR-630與IgA1及其糖基化水平之間的關(guān)系，預(yù)測miR-630候選靶基因。
　　方法:收集經(jīng)腎活檢病理檢查確診為IgA腎病患者的腭扁桃體組織27例作為實驗組（IgAN組），非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體20例作為對照組（CT組），每組患者隨機選取2例，通過AgilengtHuman miRNA microa

12、rrays V19檢測IgA腎病與非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體miRNA表達譜，分析差異表達的miRNA，并采用qRT-PCR對部分miRNA進行驗證。分離培養(yǎng)腭扁桃體單個核細胞，通過qRT-PCR檢測腭扁桃體單個核細胞miR-630表達，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液IgA1含量，IgA1-蠶豆凝集素(VVL)結(jié)合實驗檢測IgA1與VVL結(jié)合力，反映IgA1鉸鏈區(qū)糖基化水平。通過Pearson相關(guān)性分析及直線回歸對腭扁桃體單個核細胞miR

13、-630表達與IgA1含量及其低糖基化水平進行相關(guān)性分析。選取Targetscan、miRanda、PICTA5三個常用算法對miRNA-630進行靶基因預(yù)測，為減少假陽性，記錄3個軟件的交集為miRNA-630的候選靶基因，利用DAVID數(shù)據(jù)庫對候選靶基因進行GO功能(Gene Ontology)生物過程富集(GO_ BP)和信號通路分析（KEGG PATHWAY），選擇與免疫系統(tǒng)關(guān)系密切的靶基因進行下一步實驗。
　　結(jié)果:

14、r>　　1、miRNA基因芯片鑒定結(jié)果顯示IgA腎病患者與非腎病扁桃體炎患者相比，腭扁桃體差異表達miRNA共29個，其中表達上調(diào)miRNA7個，表達下調(diào)miRNA22個，改變倍數(shù)＞2倍。qRT-PCR驗證結(jié)果顯示IgA腎病患者腭扁桃體miR-630，miR-513b，miR-135a-3p，miR-642-3p表達明顯低于與非腎病扁桃體炎患者，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，miR-148-3p，miR-155-5p表達無明顯差異

15、，驗證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致。
　　2、IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞miR-630表達顯著低于非腎病扁桃體炎患者，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3、IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞培養(yǎng)上清液IgA1含量較非腎病扁桃體炎患者明顯增加(p＜0.01)，IgA1與蠶豆凝集素結(jié)合力（IgA1-VVL-binding OD值）明顯增高(p＜0.01)，間接說明IgA1糖基化水平降低。
　　4、Person相關(guān)性分

16、析及直線回歸顯示IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞miR-630表達與IgA1含量及IgA1與VVL的結(jié)合力（IgA1-VVL-binding OD值，OD值增大，間接說明IgA1糖基化水平降低）呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.733，p=0.006和r=-0.697，p=0.011。
　　5、Targetscan、miRanda、PICTA5三種軟件對miR-630進行靶基因預(yù)測，并通過GO功能分析提示miR-630的候選靶基因

17、與免疫系統(tǒng)相關(guān)。TLR4是miR-630的預(yù)測靶基因，TLR4的3'-UTR區(qū)有6個堿基對與miR-630的種子序列互補配對。
　　結(jié)論:IgA腎病患者與非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體miRNA存在差異表達，IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞miR-630表達較非腎病扁桃體炎患者明顯降低，細胞培養(yǎng)上清液IgA1分泌增加，IgA1與蠶豆凝集素結(jié)合力（IgA1-VVL-binding OD值）增大，反應(yīng)IgA1糖基化水平降低，且miR-63

18、0表達與IgA1含量及IgA1-VVL-bindingOD值負相關(guān)，提示IgA腎病患者腭扁桃miR-630表達下調(diào)可能與IgA腎病低糖基化IgA1產(chǎn)生相關(guān)。miR-630預(yù)測靶基因與免疫系統(tǒng)相關(guān)，TLR4是miR-630的預(yù)測靶基因，miR-630可能結(jié)合于TLR43'-UTR區(qū)降解TLR4 mRNA或抑制其蛋白翻譯。
　　第二章 TLR4在腭扁桃體的表達及miR-630對IgA腎病腭扁桃體單個核細胞TLR4及IgA1低糖基化表達

19、的作用
　　目的:檢測TLR4在IgA腎病與非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體的表達，分析TLR4與miR-630、IgA1及其糖基化水平之間的關(guān)系。采用miR-630 mimic轉(zhuǎn)染IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞，模擬細胞miR-630表達上調(diào)，觀察miR-630對TLR4表達、IgA1含量及其糖基化水平的影響。
　　方法:免疫組織化學(xué)染色法檢測腭扁桃體TLR4表達水平，使用圖像半定量分析法對結(jié)果進行統(tǒng)計;密度梯度離心法分離腭扁

20、桃體單個核細胞，采用qRT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測TLR4mRNA和蛋白表達。通過Pearson相關(guān)性分析及直線回歸對腭扁桃體單個核細胞TLR4表達與miR-630表達、IgA1水平及其低糖基化水平進行相關(guān)性分析。IgA腎病腭扁桃體單個核細胞轉(zhuǎn)染miR-630mimic，細胞培養(yǎng)72小時后，通過免疫熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染效率，qRT-PCR、Western blot技術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染后TLR4mRNA和蛋白

21、表達，ELISA檢測轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清液IgA1含量，IgA1-蠶豆凝集素(VVL)結(jié)合實驗檢測IgA1與VVL結(jié)合力，反映IgA1鉸鏈區(qū)糖基化水平。
　　結(jié)果:
　　1、免疫組化結(jié)果顯示IgA腎病與非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體均表達TLR4，主要分布于扁桃體淋巴小結(jié)生發(fā)中心，IgA組TLR4表達明顯增加(p＜0.05)。
　　2、qRT-PCR及Westem blot結(jié)果顯示IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞TLR4 m

22、RNA和蛋白表達較非腎病扁桃體炎患者明顯增加，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　3、Person相關(guān)性分析及直線回歸顯示IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞TLR4表達與miR-630表達呈負相關(guān)，r=-0.818，p=0.001;TLR4表達與IgA1含量及IgA1與VVL的結(jié)合力(IgA1-VVL-bindingOD值，OD值增大，間接說明IgA1糖基化水平降低)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.880，p=0.000和r=

23、0.789，p=0.002。
　　4、IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞轉(zhuǎn)染miR-630 mimic72小時后，與陰性對照及空白對照組相比，細胞形態(tài)及細胞數(shù)目無明顯改變，轉(zhuǎn)染效率約70％。qRT-PCR檢測腭扁桃體單個核細胞轉(zhuǎn)染miR-630 mimic后，miR-630表達較空白對照組升高38.7倍，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)，陰性對照組與空白對照組miR-630表達無明顯改變(p＞0.05)。
　　5、IgA腎病

24、患者腭扁桃體單個核細胞轉(zhuǎn)染miR-630 mimic72小時后，TLR4 mRNA和蛋白表達水平較空白對照組明顯降低(p＜0.01)，陰性對照組與空白對照組TLR4表達無明顯改變(p＞0.05)。
　　6、IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞轉(zhuǎn)染miR-630 mimic72小時后，細胞培養(yǎng)上清液IgA1含量較空白對照組明顯降低(p＜0.01)，陰性對照組與空白對照組無明顯差異;IgA1與蠶豆凝集素結(jié)合力（IgA1-VVL-bindi

25、ng OD值）較空白對照組降低(p＜0.05)，說明轉(zhuǎn)染后IgA1鉸鏈區(qū)半乳糖基化水平升高，陰性對照組與空白對照組無明顯差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論: IgA腎病患者腭扁桃體TLR4高表達，且TLR4表達與IgA1含量及IgA1-VVL-binding OD值（OD值增大，間接說明IgA1糖基化水平降低）正相關(guān)，提示TLR4與低糖基化IgA1產(chǎn)生相關(guān)。miR-630是TLR4的負性調(diào)節(jié)因子，miR-630可抑制TLR4表達，減