IgA腎病扁桃體細(xì)胞上清對(duì)腎系膜細(xì)胞及小管細(xì)胞的影響.pdf

1、IgA腎病(IgAN,IgA nephropathy)是一類以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為主要特征的疾病，是最常見的原發(fā)性腎炎之一。病因不明，預(yù)后不佳，目前仍缺乏有效的治療方法，每年約有1～2％的IgAN患者進(jìn)入終末腎衰竭，需要腎臟替代治療。加之本病好發(fā)于青少年，男多于女，給國(guó)家和個(gè)人帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，對(duì)其病因和發(fā)病、疾病進(jìn)展機(jī)制的研究成為全世界醫(yī)學(xué)工作者尤其是廣大腎病學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。
　　 IgAN患者TMCs

2、在PHA刺激后的分泌產(chǎn)物除了對(duì)扁桃體自身免疫產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，是否會(huì)對(duì)人腎臟固有細(xì)胞，如腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化產(chǎn)生影響，與非IgAN的慢性扁桃體炎患者比較是否有明顯差異，目前尚未見報(bào)道。前期的研究發(fā)現(xiàn)IgAN患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(periferal blood monouclear cells,PBMCs)培養(yǎng)上清與腎小球系膜細(xì)胞共培養(yǎng)可以上調(diào)ICAM-1表達(dá)，TMCs培養(yǎng)上清與系膜細(xì)胞共培養(yǎng)，較非IgAN慢性扁桃體炎

3、患者，可以上調(diào)系膜細(xì)胞TGF-β1，PAI-1，IL-6的表達(dá)。單一的細(xì)胞因子作用研究很多，但體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，不同的細(xì)胞因子共存時(shí)可能出現(xiàn)多效、重疊、拮抗或協(xié)同的作用。因此，在IgAN中，為了以接近體內(nèi)的狀況來觀察TMCs及其產(chǎn)物在IgAN發(fā)病機(jī)制中的可能作用，我們收集IgAN和非IgAN慢性扁桃體炎患者手術(shù)切除的扁桃體，分離其中的TMCs并收集上清，直接作用于人腎小球系膜細(xì)胞(HMC)和人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，并收集TMCs培養(yǎng)上

4、清與HMC共培養(yǎng)后的上清再作用于HK-2細(xì)胞，觀察這兩種腎臟固有細(xì)胞間的相互聯(lián)系及不同細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞的增殖與分化作用上的差異，并初步探討相關(guān)可能機(jī)制，探索扁桃體免疫在IgAN發(fā)病、疾病進(jìn)展中的可能作用。本研究共分為兩部分。
　　 第一部分 IgA腎病患者TMCs培養(yǎng)上清對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制研究
　　 目的：
　　 觀察IgA腎病患者TMCs培養(yǎng)上清對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞凋

5、亡的影響及相關(guān)機(jī)制，探討IgA腎病TMCs分泌產(chǎn)物在IgA腎病中的可能作用。
　　 方法：
　　 收集13例IgAN和非IgAN CT患者手術(shù)摘除的右側(cè)扁桃體，分離TMCs進(jìn)行體外培養(yǎng)；各組病人均分PHA刺激和未刺激兩小組培養(yǎng)，PHA體外刺激TMCs72小時(shí)，收集PHA刺激和未刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清液；將PHA刺激和未刺激的IgAN和非IgAN CT患者TMCs混合培養(yǎng)上清按所需濃度與人腎小球系膜細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，流式細(xì)胞

6、儀測(cè)定系膜細(xì)胞凋亡率，RT-PCR檢測(cè)系膜細(xì)胞Bcl-2，Bax，F(xiàn)as mRNA的表達(dá)；應(yīng)用ELISA檢測(cè)PHA刺激和未刺激的TMCs培養(yǎng)上清液中的TGF-β1水平。
　　 結(jié)果：
　　 PHA刺激的IgAN患者TMCs上清與人腎小球系膜細(xì)胞共培養(yǎng)后，與陰性對(duì)照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非IgANCT組相比，系膜細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P＜0.05)。系膜細(xì)胞的Bcl-2/β-actin mR

7、NA下調(diào)至陰性對(duì)照組的25％，Bax/Bcl-2比值增加至陰性對(duì)照組的4.3倍，與陰性對(duì)照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IgA腎病患者TMCs PHA刺激的上清亦可使Fas/β-actin mRNA表達(dá)增加至陰性對(duì)照組的2.38倍，與陰性對(duì)照組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IgA腎病患者TMCs培養(yǎng)上清液中T

8、GF-β1表達(dá)水平較非IgAN慢性扁桃體炎患者，明顯升高(P＜0.05)，但PHA刺激組與未刺激組兩組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.IgAN的TMCs體外PHA刺激的培養(yǎng)上清與人腎小球系膜細(xì)胞共培養(yǎng)后能促進(jìn)系膜細(xì)胞的凋亡，此機(jī)制可能與其下調(diào)系膜細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)，增加Bax/Bcl-2比例，上調(diào)Fas基因表達(dá)有關(guān)。
　　 2.IgA腎病患者的TMCs培養(yǎng)上清液中TGF-

9、β1表達(dá)水平明顯升高，PHA體外刺激不能顯著誘導(dǎo)TMCs生成TGF-β1。IgAN患者TMCs培養(yǎng)上清液中的TGF-β1水平的高低可能與其增加系膜細(xì)胞凋亡率的作用無關(guān)。
　　 第二部分 IgA腎病患者TMCs培養(yǎng)上清對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)分化研究
　　 目的：
　　 觀察IgAN患者TMCs培養(yǎng)上清及其與人腎小球系膜細(xì)胞共培養(yǎng)后的相應(yīng)系膜細(xì)胞上清對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)分化的影響，探討IgA腎病

10、rMCs分泌產(chǎn)物在IgAN中的可能作用。
　　 方法：
　　 將PHA刺激和未刺激的IgAN和非IgAN CT患者TMCs培養(yǎng)上清按20％濃度加入培基與人腎小球系膜細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，收集不同TMCs相應(yīng)的混合系膜細(xì)胞上清。不同濃度的TMCs培養(yǎng)上清及其相應(yīng)的系膜細(xì)胞上清與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)，在12小時(shí)，24小時(shí)，用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖。TMCs培養(yǎng)上清及其相應(yīng)的系膜細(xì)胞上清按所需濃度與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，采

11、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2細(xì)胞凋亡率的改變。采用RT-PCR檢測(cè)HK-2細(xì)胞Bcl-2，Bax，E-cadherin和α-SMA mRNA的表達(dá)，采用Western Blot檢測(cè)E-cadherin和α-SMA蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 PHA刺激的IgAN患者TMCs上清及其相應(yīng)的系膜細(xì)胞上清以20％的濃度加入培基與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，與陰性對(duì)照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非Ig

12、AN CT組相比，HK-2細(xì)胞的存活率明顯降低(P＜0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)，且細(xì)胞存活率隨上清濃度的升高而降低，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)亦降低。PHA刺激的IgAN患者TMCs上清與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)后，HK-2細(xì)胞的Bcl-2/β-actin mRNA下降至陰性對(duì)照組的40％，Bax/Bcl-2比值增加至陰性對(duì)照組的2.41倍，與陰性對(duì)照組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。亦

13、可使HK-2細(xì)胞的E-cadherin/β-actin mRNA下降至陰性對(duì)照組的43％，與陰性對(duì)照組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。并增加HK-2細(xì)胞的α-SMA mRNA表達(dá)，與陰性對(duì)照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PHA刺激的IgAN患者TMCs相應(yīng)的系膜細(xì)胞上清與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)后，可使HK-2細(xì)胞的

14、Bcl-2/β-actin mRNA下調(diào)至陰性對(duì)照的47％，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并使Bax/Bcl-2比值增加至陰性對(duì)照組的2.23倍，與陰性對(duì)照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。亦可使HK-2細(xì)胞的E-cadherin/β-actin mRNA降低至陰性對(duì)照組的66％，并增加HK-2細(xì)胞的α-SMA mRNA表達(dá)，與陰性對(duì)照組

15、、PHA刺激的非IgANCT組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在蛋白水平，PHA刺激的IgAN患者TMCs上清與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)后，HK-2細(xì)胞的E-cadherin/β-actin下降至陰性對(duì)照組的50％，與陰性對(duì)照組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。并增加HK-2細(xì)胞的α-SMA蛋白表達(dá)，與陰性對(duì)照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PH

16、A刺激的IgAN患者TMCs相應(yīng)的系膜細(xì)胞上清與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)后，HK-2細(xì)胞的E-cadhein/β-actin下降至陰性對(duì)照組的47％，并增加HK-2細(xì)胞的α-SMA蛋白表達(dá)，與陰性對(duì)照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 PHA刺激后的IgAN的TMCs培養(yǎng)上清及其相應(yīng)的系膜細(xì)胞上清與人腎小管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，HK-