2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是我國養(yǎng)豬業(yè)中重要的傳染病之一,造成了巨大的經濟損失。目前防控PRRS的主要手段為疫苗接種,但保護效果欠佳,且活疫苗存在安全隱患。RNA干擾是一種真核細胞固有的轉錄后基因沉默機制,也是先天性抗病毒機制,目前已發(fā)展成為有效的抗病毒感染策略。據報導,基因工程載體表達的人工微小RNA(artificial miRNA,am

2、iRNA)能夠作為有效的抗病毒手段,而人和小鼠的外排體(exosome)可以作為微小RNA的傳遞載體。
  PRRSV主要感染豬的單核-巨噬細胞系統(tǒng),特別是豬肺巨噬細胞(porcine alveolarmacrophage,PAM)。參與PAM感染的受體主要有CD163和唾液酸粘附素(sialoadhesin,Sn)或稱CD169,前者是起主要作用的核心受體,后者是起次要作用的輔助受體。PRRSV基因組5'和3'非翻譯區(qū)(untr

3、anslated region,UTR)含有高度保守的順式調控序列,在病毒復制中發(fā)揮關鍵作用。為了研究控制PRRS的新策略,本研究構建了表達CD163、Sn和3'UTR amiRNA的重組腺病毒(recombinant adenovirus,tAd),并在細胞水平上研究rAd和外排體傳導的amiRNA對PRRSV感染或復制的抑制作用。
  為了研究CD163和Sn特異amiRNA對PRRSV感染的抑制作用,分別將兩個amiRNA表

4、達盒插入腺病毒載體,用重組載體轉染AAV-293細胞,獲得了兩株rAd。流式細胞術和熒光顯微鏡觀察結果顯示,rAd能有效轉導PK-15細胞,感染指數(MOI)為100時的轉導效率可達100%;原代PAM細胞的轉導效率很低,MOI為800時的轉導效率僅達62%。Real-time RT-PCR檢測結果顯示,rAd轉導細胞不僅能有效表達序列特異amiRNA,而且表達的amiRNA能通過外排體分泌到細胞外。Real-time RT-PCR和流

5、式細胞術檢測結果顯示,rAd表達和外排體傳送的amiRNA均能顯著抑制CD163和Sn基因轉錄和蛋白表達,兩種方式同時傳遞amiRNA的抑制作用更強。Real-time RT-PCR和病毒滴定結果顯示,兩種rAd轉導和含兩種amiRNA外排體孵育PAM細胞可顯著降低PRRSV ORF7拷貝數和病毒滴度,抑制作用可持續(xù)96小時,對3株不同毒力PRRSV感染具有相同的抑制效果。這些研究資料表明,rAd是有效的amiRNA表達載體,豬細胞源外

6、排體可作為amiRNA的傳送載體,兩種方式共同傳送的CD163和Sn特異amiRNA對抑制PRRSV感染PAM細胞具有相加作用。
  為了研究不同細胞源外排體向PAM細胞傳送amiRNA的效率,將PRRSV3'UTR特異amiRNA表達盒插入腺病毒載體,用重組載體轉染AAV-293細胞,用獲得的rAd分別轉導豬腎細胞系PK-15、豬肺巨噬細胞系3D4/163、原代豬腎成纖維細胞PFC和子宮內皮細胞PEEC,從轉導細胞培養(yǎng)液分離外排

7、體。Real-time RT-PCR檢測結果顯示,rAd轉導的4種豬源細胞不僅能有效表達序列特異amiRNA,而且表達的amiRNA能通過外排體分泌到細胞外,但不同細胞分泌amiRNA的能力有所差異。熒光顯微鏡觀察結果顯示,熒光染料標記的外排體能被上述4種類型細胞和原代PAM細胞有效攝取。Real-timeRT-PCR檢測結果顯示,原代PAM細胞能有效攝取4種細胞源外排體及其amiRNA,并具有時間和劑量依賴性。Real-time RT

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