人血清脂聯(lián)素定量ELISA檢測方法的建立及脂聯(lián)素的可溶表達.pdf

1、脂聯(lián)素(adiponectin)是脂肪細胞特異分泌的血漿蛋白，它與胰島素抵抗、動脈粥樣硬化等密切相關，檢測adiponectin在血中的含量是研究其生理學功能及調控的手段之一，對于預測某些疾病的發(fā)生、發(fā)展有一定的意義。另外，由于adiponectin的活性主要集中在其球狀區(qū)(gadiponectin)，而可溶蛋白又較包涵體有可能形成正確的折疊，從而具有一定的生物學活性，所以對adiponectin及gadiponectin的可溶表達將為

2、其功能和作用機制的研究奠定基礎，同時還能進一步制備ELISA檢測所需的針對不同抗原表位的單、多克隆抗體。目前，國外檢測人血adiponectin含量的方法主要有ELISA及RIA兩種，其中ELISA大多采用生物素-親和素信號放大系統(tǒng)，操作相對煩瑣，檢測周期較長，而國內尚無此類成套試劑。 目的：我們試圖建立一簡便、快捷的檢測人血中adiponectin含量的ELISA方法，檢測Ⅱ型糖尿病患者及健康體檢者血中adiponectin的

3、變化；并試圖克隆表達有生物學活性的adiponectin及gadiponectin蛋白，并制備多克隆抗體，以利下一步進一步優(yōu)化相關檢測方法。 方法：用純化的大腸桿菌重組表達包涵體adiponectin，免疫家兔和Balb/C小鼠分別制備多克隆和單克隆抗人adiponectin抗體，純化后，用單抗包被微孔板，多抗標上辣根過氧化物酶，同時制備了一種新型血清或血漿樣品稀釋液，雙抗體夾心法檢測adiponectin，繪制標準曲線，檢測Ⅱ

4、型糖尿病和健康體檢者血標本中adiponectin的含量，并進行統(tǒng)計學分析。為在此基礎上進一步優(yōu)化檢測方法，我們以pQE30-adiponectin質粒為模板，PCR分別擴增adiponectin及gadiponectinDNA，并插入pGEX-4T-2表達載體，轉化入BL21大腸桿菌，在25℃使用IPTG誘導，進行可溶性表達?？扇鼙磉_的蛋白經GSTrap柱親和純化后免疫家兔，制備多抗，利用Westernblot鑒定多抗與人血清中adi

5、ponectin的反應性。使用肝癌細胞和外周血單個核細胞對可溶表達蛋白進行體外生物學活性鑒定。 結果：我們建立的ELISA系統(tǒng)的靈敏度為0.5μg/ml，板內、板間的精密度＜8％。血清檢測線性關系較好，準確性在88％-108％。新研制的血清或血漿樣品稀釋液是本檢測系統(tǒng)不可缺少的部分，并已申請了國家發(fā)明專利。檢測北京醫(yī)院Ⅱ型糖尿病家系血清，與市售Linco試劑的相關性良好(r=0.71)，在調整了年齡、性別比和體重指數(shù)(BMI)后

6、，Ⅱ型糖尿病患者血中adiponectin的濃度低于健康體檢者(4.04±2.39vs5.87±2.96μg/mlt=3.12p=0.002)。在健康體檢者，血中adiponectin濃度與甘油三酯(TG)呈顯著負相關(r=-0.367p=0.009)，且在健康女性，血中adiponectin濃度負相關于BMI(r=-0.413p=0.023)。對301醫(yī)院內分泌實驗室提供的血清標本檢測結果亦表明Ⅱ型糖尿病患者血中adiponectin

7、的濃度顯著低于健康體檢者(4.26±2.65vs7.98±4.39μg/mlt=4.58p＜0.0001)。 PCR擴增的adiponectin編碼DNA約710bp，gadiponectin編碼DNA約430bp，構建了pGEX-4T-2-adiponectin和pGEX-4T-2-gadiponectin表達載體。將載體轉化入BL21大腸桿菌后，使用IPTG在25℃誘導，有可溶表達的GST-adiponectin融合蛋白分子

8、量約51kDa，GST-gadiponectin融合蛋白分子量約42kDa，經親和純化后，純度均＞90％。體外實驗結果顯示，兩種可溶表達的重組蛋白對肝癌細胞具殺傷作用，且對外周血單個核細胞無細胞毒作用。兩種融合蛋白免疫家兔，產生的多抗，與人血清中的adiponectin均能特異性結合。 結論：我們初步建立了一種簡便、快捷的ELISA檢測人血中adiponectin含量的方法，血中adiponectin濃度在Ⅱ型糖尿病患者降低，與