不同濃度葡萄糖對胰島β細(xì)胞株(NIT-1細(xì)胞)IRS2、FOXO1和TSC2的表達(dá)及與NIT-1細(xì)胞分泌功能、增殖和凋亡之間關(guān)系的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分、不同葡萄糖濃度對胰島細(xì)胞分泌功能和細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：探討不同濃度葡萄糖對胰島細(xì)胞胰島素分泌、細(xì)胞增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制。
　　 方法：摘除小鼠胰腺組織，并進(jìn)行胰島分離和純化，分別按小鼠100個胰島/孔接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，隨機(jī)進(jìn)入各處理組（5.6組（含葡萄糖5.6 mmol/L）、7.8組（7.8 mmol/L）、11.1組（11.1 mmo

2、l/L）、16.7組（16.7 mmol/L）、22.2組(22.2 mmol/L)及27.6組（27.6 mmol/L）再培養(yǎng)72小時，取上清應(yīng)用放射免疫法檢測胰島素水平；免疫組織化學(xué)染色檢測胰島細(xì)胞NF-Κb；免疫熒光染色檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞色素C釋放和Bax激活的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)胰島細(xì)胞在11.1mmol/L濃度葡萄糖作用下胰島素細(xì)胞凋亡率呈最低狀態(tài)，胰島細(xì)胞凋亡率則隨著時間的延長和葡萄糖濃度的

3、升高而顯著增高（P均<0.05）。
　　 (2)胰島細(xì)胞在11.1mmol/L濃度葡萄糖作用下胰島素呈最高分泌狀態(tài)，之后隨糖濃度增加而漸次減少（各組與11.1組比較P均<0.05）。組間兩兩比較均有顯著性差異（P均＜0.001）。
　　 (3)葡萄糖濃度為5.6mmol/L時胰島細(xì)胞的NF-Κb的表達(dá)最低。之后隨著糖濃度增加NF-Κb表達(dá)增加，且各組有顯著性差異（P<0.05）。
　　 (4)胰島細(xì)胞在11.1m

4、mol/L濃度葡萄糖作用下IRS-2表達(dá)最高，之后隨著糖濃度增加而減少（各組與11.1組比較P均<0.05）。
　　 (5)葡萄糖濃度為5.6mmol/L時胰島細(xì)胞的Bax 激活狀態(tài)最低（各組與5.6組比較P均<0.05），接下來隨著糖濃度增加Bax 激活百分率增加，且各組有顯著性差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：胰島細(xì)胞在11.1mmol/L濃度葡萄糖作用下細(xì)胞凋亡最低，胰島素分泌水平最高，但隨著葡萄糖濃度的升高細(xì)胞

5、凋亡逐漸升高，胰島素分泌量逐漸下降；高濃度葡萄糖通過降低IRS-2的表達(dá)、增強(qiáng)Bax激活和細(xì)胞色素C釋放以及增加NF-Kb表達(dá)，從而阻礙胰島β細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡，并且減少胰島素分泌。
　　 第二部分、不同濃度葡萄糖對小鼠胰島β細(xì)胞株（NIT-1細(xì)胞）IRS2、FOXO1和TSC2表達(dá)及與NIT-1細(xì)胞胰島素分泌、增殖和凋亡的影響
　　 目的：探討不同濃度葡萄糖對小鼠胰島β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞中IRS2、FOXO1

6、和TSC2信號分子的表達(dá)的影響及與NIT-1細(xì)胞胰島素分泌功能及細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系。
　　 方法：將 NIT-1細(xì)胞按5×104個細(xì)胞/孔置于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48小時后，隨機(jī)進(jìn)入各處理組（5.6組（含葡萄糖5.6 mmol/L）、7.8組（7.8 mmol/L）、11.1組（11.1 mmol/L）、16.7組（16.7 mmol/L）、22.2組(22.2 mmol/L)及27.6組（27.6 mmol/L）再培養(yǎng)72小時

7、，再分別于48h、72h、96h和120h取培養(yǎng)上清，采用放免法檢測胰島素水平，同步采用免疫熒光染色檢測細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖采用MTT法檢測，應(yīng)用RT-PCR半定量方法檢測各組120h時的 IRS-2、p-FoxO1和TSC2mRNA表達(dá)，應(yīng)用蛋白免疫印跡方法（Western Blot）檢測IRS-2和p-FoxO1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)NIT-1細(xì)胞在11.1mmol/L濃度葡萄糖作用下細(xì)胞呈最高增殖狀

8、態(tài)，之后隨糖濃度增加而逐漸減少（P均<0.05）。
　　 (2)NIT-1細(xì)胞凋亡率則隨著葡萄糖濃度的升高和時間的延長而顯著增高（P均<0.05）。
　　 (3)NIT-1細(xì)胞在11.1mmol/L濃度葡萄糖作用下胰島素呈最高分泌狀態(tài)，之后隨糖濃度增加而漸次減少（各組與11.1組比較，P均<0.05）。組間兩兩比較均有顯著性差異（P均＜0.001）。
　　 (4)當(dāng)葡萄糖濃度為11.1 mmol/L時，NIT-1

9、細(xì)胞IRS-2蛋白及Mrna表達(dá)水平最高（各組與11.1組比較P均<0.05）；其余各組隨著糖濃度升高，IRS-2蛋白表達(dá)呈逐漸減少，組間兩兩比較也均有顯著性差異（P<0.05）。
　　 (5)當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)11.1mmol/L時，NIT-1細(xì)胞的p-FoxO1蛋白表達(dá)水平最高（各組與11.1組比較P均<0.05）；其余各組隨著糖濃度升高，p-FoxO1蛋白表達(dá)呈逐漸減少，組間兩兩比較均有顯著性差異（P<0.05）；而葡萄糖濃度

10、在5.6mmol/L時（與其余各組相比P<0.05），此時FOXO1基因的Mrna表達(dá)最低，而隨著葡萄糖濃度升高，F(xiàn)OXO1的Mrna表達(dá)也呈不斷增加狀態(tài)。
　　 (6)當(dāng)葡萄糖濃度在5.6mmol/L時，TSC2基因的Mrna表達(dá)最低（各組與11.1組比較P均<0.05），而隨著葡萄糖濃度的不斷升高，TSC2基因的Mrna轉(zhuǎn)錄水平也呈不斷增加狀態(tài)。
　　 結(jié)論：NIT-1細(xì)胞在11.1mmol/L濃度葡萄糖作用下細(xì)胞胰

11、島素分泌、細(xì)胞增殖呈最高狀態(tài)，細(xì)胞凋亡率最低，但隨著葡萄糖濃度的升高，胰島素分泌和細(xì)胞增殖下降，凋亡增高；同時，高濃度葡萄糖通過降低FOXO1磷酸化水平、增加核定位的FOXO1、發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的活性，阻礙了胰島β細(xì)胞分泌、抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。通過高濃度葡萄糖下調(diào)IRS-2的表達(dá)和上調(diào)TSC2mRNA表達(dá)的雙重作用，抑制了細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這些因素直接或間接的共同作用地減少胰島β細(xì)胞的分泌功能。
　　 第三部分

12、、羅格列酮對不同葡萄糖條件下小鼠胰島β細(xì)胞株(NIT-1細(xì)胞)IRS2、FOXO1和TSC2表達(dá)及對NIT-1細(xì)胞胰島素分泌功能、細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 目的：研究羅格列酮在不同濃度葡萄糖條件下，對β細(xì)胞內(nèi)IRS-2、FOX01和TSC2的表達(dá)的影響，探討IRS-2、FOX01和TSC2的表達(dá)對胰島β細(xì)胞功能及增殖凋亡的影響。
　　 方法：將 NIT-1細(xì)胞按5×104個細(xì)胞/孔至24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48小時后，隨機(jī)進(jìn)

13、入各處理組（5.6組（含葡萄糖5.6 mmol/L）、7.8組（7.8 mmol/L）、11.1組（11.1 mmol/L）、16.7組（16.7 mmol/L）、22.2組(22.2 mmol/L)及27.6組（27.6 mmol/L）再培養(yǎng)24小時時，分別施與10-5羅格列酮干預(yù)24h和48h，于24h和48h取上清液，采用放免法檢測胰島素水平，同步采用免疫熒光染色檢測細(xì)胞凋亡，應(yīng)用RT-PCR半定量方法檢測各組干預(yù)48h時的IRS

14、-2、p-FoxO1和TSC2mRNA表達(dá)，應(yīng)用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測IRS-2和p-FoxO1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)羅格列酮能夠明顯抑制高葡萄糖濃度誘導(dǎo)的NIT-1細(xì)胞凋亡。施加濃度為10-5 mmol/L羅格列酮24h后，能夠明顯抑制22.5 mmol/L和27.6 mmol/L濃度葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且在48h時進(jìn)一步抑制16.7 mmol/L及以上濃度葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋

15、亡（與對照組比較P均＜0.05）。
　　 (2)羅格列酮能增強(qiáng)不同濃度葡萄糖培養(yǎng)的NIT-1細(xì)胞的IRS-2蛋白及Mrna表達(dá)，其趨勢仍是11.1組＞16.7組＞22.5組＞27.6組狀態(tài)，IRS-2蛋白表達(dá)增高的趨勢和胰島素分泌水平、細(xì)胞增殖的水平基本一致，但與細(xì)胞凋亡百分率的大小相反。
　　 (3)10-5 mol/l的羅格列酮干預(yù)后，p-FoxO1蛋白表達(dá)水平較未干預(yù)組明顯增高（P均<0.05），趨勢與羅格列酮未干

16、預(yù)組一致，分別為11.1組＞16.7組＞22.5組＞27.6組，與IRS-2的表達(dá)、胰島素分泌量及細(xì)胞增殖百分率趨勢相一致，與細(xì)胞凋亡率變化相反；在10-5mmol/L羅格列酮干預(yù)后，p-FoxO1mRNA表達(dá)水平較未干預(yù)組明顯降低（P均<0.05），趨勢與未干預(yù)組一致，仍為5.6組＜11.1組＜16.7組＜22.5組＜27.6組。
　　 (4)10-5mol/l的羅格列酮干預(yù)后，總體TSC-2 Mrna的表達(dá)較未干預(yù)組明顯下降