RSK4在人體正常組織的分布及其在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)和功能的初步研究.pdf

1、【研究背景】
　　腎細(xì)胞癌（renalcellcarcinoma，RCC）是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占成年人所有上皮來(lái)源惡性腫瘤的4％。由于RCC起病隱匿，常導(dǎo)致約30％患者在初次確診時(shí)已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移；另外，該腫瘤對(duì)放化療不敏感，且在手術(shù)切除后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，給臨床診療工作帶來(lái)極大的困難。因此，探索針對(duì)RCC的敏感特異的早期診斷、鑒別診斷和評(píng)估預(yù)后的標(biāo)志物，以及新的、有效的治療靶點(diǎn)十分必要。
　　RSK4是核糖體s6蛋白激酶(

2、ribosomals6kinase，RSK)基因家族成員之一，由746個(gè)氨基酸組成，作為RSK家族的新成員，其分子功能甚不清楚。迄今為止，RSK4相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道很少，其組織分布尚未完全明確，僅有個(gè)別文獻(xiàn)報(bào)道了其mRNA在人部分正常組織的分布，而關(guān)于RSK4蛋白在人正常及常見(jiàn)腫瘤組織的分布尚未見(jiàn)系統(tǒng)性報(bào)道。此外，目前研究大多認(rèn)為，RSK4是一種潛在的抑癌基因，即RSK4在一些腫瘤中表達(dá)降低且其過(guò)表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞系的侵襲及轉(zhuǎn)移。而關(guān)于R

3、SK4在RCC的表達(dá)及其功能仍知之甚少，僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道RCC新鮮腫瘤組織中的RSK4mRNA水平低于癌旁組織，且作者認(rèn)為其可能的機(jī)制是RSK4通過(guò)誘導(dǎo)老化而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。因此，RSK4蛋白在人正常及常見(jiàn)腫瘤組織的表達(dá)與分布究竟如何?RSK4在RCC中的表達(dá)情況究竟如何？其功能是促癌還是抑癌作用？正是本研究旨在解決的問(wèn)題。
　　【目的】
　　1.研究RSK4在人體正常組織和常見(jiàn)惡性腫瘤組織的表達(dá)，為深入研究其功能提供研

4、究基礎(chǔ)；
　　2.研究RSK4在RCC的表達(dá)，分析其與患者臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系；
　　3.初步探討RSK4在RCC細(xì)胞系中的表達(dá)及其功能的分子機(jī)制。
　　【方法】
　　1.應(yīng)用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)EnVision法，分別檢測(cè)RSK4蛋白在人30種正常組織和54種腫瘤組織的表達(dá)；
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)EnVision法研究RSK4在31例RCC芯片組織及70例RCC手術(shù)標(biāo)本中的表達(dá)情況；

5、>　　3.應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析RSK4的表達(dá)與RCC患者臨床病理特征的關(guān)系；
　　4.應(yīng)用Kaplan-Meier法及Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析RSK4的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，并繪制生存曲線；
　　5.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR及WesternBlot檢測(cè)RSK4在RCC細(xì)胞系RPC及GRC-1中的表達(dá)；
　　6.應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)或低表達(dá)RCC細(xì)胞系中RSK4，并從蛋白和mRNA水平進(jìn)行驗(yàn)證；
　　7.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

6、RSK4的表達(dá)變化對(duì)RCC細(xì)胞周期的影響；
　　8.應(yīng)用Transwell技術(shù)檢測(cè)RSK4的表達(dá)變化對(duì)RCC細(xì)胞浸潤(rùn)及遷移能力的影響。
　　【結(jié)果】
　　1.人30種正常組織有12種組織不同程度的表達(dá)RSK4，其中胰腺導(dǎo)管上皮、涎腺上皮細(xì)胞、皮膚的汗腺上皮細(xì)胞及扁桃體的生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞等呈現(xiàn)RSK4強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而腎小管上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞及肝細(xì)胞等RSK4的表達(dá)較弱；而54種腫瘤組織中有14種組織出

7、現(xiàn)RSK4強(qiáng)弱不等的陽(yáng)性表達(dá)，其中腎透明細(xì)胞癌、子宮透明細(xì)胞癌、卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌及胃腺癌的RSK4表達(dá)較強(qiáng)，而乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及肝細(xì)胞肝癌等表達(dá)較弱；
　　2.RSK4在RCC組織芯片及手術(shù)收集的RCC標(biāo)本中的陽(yáng)性率分別為74％（23/31）和55％（39/70）；
　　3.31例RCC芯片組織中，RSK4的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、病理類(lèi)型及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05），但與腫瘤的F

8、uhrman核分級(jí)（P=0.032）和分期（P=0.029）顯著正相關(guān)，其陽(yáng)性表達(dá)隨著分期或分級(jí)的增高而增強(qiáng)；
　　4.70例手術(shù)收集的RCC標(biāo)本中，RSK4的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05），但其陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的高Fuhrman分級(jí)（P<0.001）、高病理分期（P=0.006）及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.012）顯著正相關(guān)；另外，RSK4的陽(yáng)性表達(dá)在不同RCC病理類(lèi)型中存在顯著性差異

9、（P=0.038），表現(xiàn)為透明細(xì)胞癌（77.8％，14/18）高于乳頭狀癌（50％，21/42），而后者又高于嫌色細(xì)胞癌（16.7％，1/6），且乳頭狀癌中2型（71.4％，20/28）的RSK4陽(yáng)性率顯著高于1型（7.1％，1/14，P<0.001））；
　　5.單因素及多因素生存分析顯示，RSK4陽(yáng)性表達(dá)與RCC患者不良預(yù)后顯著相關(guān)（P=0.001）；同時(shí)，RSK4的陽(yáng)性表達(dá)還與乳頭狀癌患者的不良預(yù)后亦相關(guān)（P=0.032）；

10、
　　6.實(shí)時(shí)定量PCR和WesternBlot結(jié)果表明，RCC細(xì)胞系中RSK4的mRNA和蛋白水平高于正常腎小管上皮細(xì)胞系，且不同的RCC細(xì)胞系間RSK4的表達(dá)水平不同；
　　7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)RSK4的RPC細(xì)胞與未處理RPC細(xì)胞相比，其處于G0-G1期的細(xì)胞比例減少（71.08±0.51vs.73.46±0.24，P<0.05），處于S期的細(xì)胞比例上升（17.95±0.18vs.15.69±0.

11、36，P<0.05），但G2-M期的細(xì)胞比例未見(jiàn)明顯差異(10.97±0.49vs.10.85±0.39，P>0.05)；而低表達(dá)RSK4的GRC-1細(xì)胞與未處理GRC-1細(xì)胞相比，處于G0-G1期的細(xì)胞比例明顯升高（75.39±0.25vs.59.68±0.21，P<0.05），而處于S期和G2-M期的細(xì)胞比例則明顯下降（19.85±0.87vs.27.92±0.87；4.76±0.14vs.12.40±0.27，P<0.05）；

12、r>　　8.Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)RSK4的RPC細(xì)胞，其發(fā)生侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)明顯增加，是未處理RPC組的2.2倍（2.2±0.11vs.1，P<0.05）；而低表達(dá)RSK4的GRC-1細(xì)胞，其發(fā)生侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)則明顯減少，約為未處理RPC組的1/3（0.36±0.05vs.1，P<0.05）。
　　【結(jié)論】
　　1.首次系統(tǒng)研究并揭示了RSK4蛋白在人類(lèi)正常組織和常見(jiàn)惡性腫瘤組織的表達(dá)與分布；