DDR2與酒精性肝纖維化的關(guān)系及復(fù)方甘草酸苷的干預(yù)和治療作用.pdf

1、目的：建立酒精性肝纖維化大鼠模型，探討DDR2基因和蛋白在酒精性肝纖維化大鼠肝組織中的表達(dá)、作用及其意義，以揭示肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制；同時(shí)從血清學(xué)、組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)方面研究復(fù)方甘草酸苷對(duì)酒精性肝纖維化大鼠的干預(yù)及治療作用，為臨床治療或逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法79口、雄性Wistar大鼠正常飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組：模型組(48只)、干預(yù)組(11只)、吡唑組(10只)和對(duì)照組(10只)。以橄欖油拌平衡飼料喂養(yǎng)大鼠

2、的基礎(chǔ)上給予胃內(nèi)灌注。①模型組：予酒精和吡嘩每日分2次灌胃。酒精的量(4-9.6g/Kg·d)及濃度(30％-60％)逐漸遞增，吡唑用量為25mg/Kg·d。②干預(yù)組：予酒精、吡唑和復(fù)方甘草酸苷(1片/Kg·d，每日分2次)灌胃，酒精和吡嘩的用法、用量同模型組。③對(duì)照組：予等量生理鹽水每日分2次灌胃。④吡唑組：予溶有吡唑的等量生理鹽水灌胃，吡唑的用法及用量同前。分別于灌胃4周、8周術(shù)時(shí)，各組隨機(jī)取1只處死，觀察肝組織病理變化。造模至12

3、周術(shù)模型組隨機(jī)取8只處死(即模型Ⅰ組)，干預(yù)組(9只)、吡唑組和對(duì)照組(各8只)全部處死。以自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功、血脂、血糖等指標(biāo)，放免檢測(cè)血清中HA、LN、PCⅢP和CⅣ含量。取肝組織標(biāo)本，一部分行Masson染色、免疫組織化學(xué)染色(觀察Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原在肝組織中的分布)及電鏡標(biāo)本制作(觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)變化)；另一部分以熒光定量-PCR和Western blot檢測(cè)DDR2基因和蛋白表達(dá)。模型組剩余大鼠繼續(xù)灌胃，至16周術(shù)再處死6

4、只(即模型Ⅱ組)，余者隨機(jī)分為4組(每組8只)，繼續(xù)給予原有橄欖油拌平衡飼料飲食，即①治療Ⅰ組：停止酒精及吡唑灌胃，給予復(fù)方甘草酸苷治療。②治療Ⅱ組：繼續(xù)酒精及吡唑灌胃的同時(shí)給予復(fù)方甘草酸苷治療。③治療對(duì)照組：停止酒精及吡唑灌胃，即僅有普通飲食。④未治療組(即模型Ⅲ組)：繼續(xù)酒精及吡唑灌胃，不予治療。至20周末全部處死，檢測(cè)內(nèi)容同上。 結(jié)果模型組①肝組織病理觀察：模型Ⅰ組可見(jiàn)匯管區(qū)增生、擴(kuò)大，中央靜脈周圍輕度纖維組織增生；模型Ⅲ

5、組中央靜脈周圍及匯管區(qū)出現(xiàn)更為廣泛的纖維組織增生，相互連接成片，表現(xiàn)為中度纖維化；模型Ⅱ組病理改變介于兩者之間。②Masson染色圖像分析：模型Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組膠原的面密度逐漸升高，模型Ⅱ組和Ⅲ組之間比較有顯著差異(P<0.05)。③免疫組化染色分析：Ⅰ型膠原多位于匯管區(qū)和中央靜脈管壁，Ⅲ型膠原多見(jiàn)于中央靜脈周圍的肝細(xì)胞漿及纖維間隔處，Ⅳ型膠原主要位于Disse間隙內(nèi)皮下基底膜：三種膠原隨建模時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸增多，以Ⅰ、Ⅳ型膠原增加為主。

6、④血清AST、HA、PCⅢ等水平隨肝損傷及纖維化程度的加重逐漸升高(P<0.05)，AST、ALP、HA、CⅣ的升高更為顯著(P<0.01)。⑤電鏡觀察：隨建模進(jìn)行，模型組細(xì)胞損傷逐漸加重，膠原纖維逐漸增多。模型Ⅰ組肝細(xì)胞間及竇周出現(xiàn)大量交織排列的纖維束；模型Ⅱ組肝細(xì)胞呈凋亡改變；模型Ⅲ組肝細(xì)胞微絨毛明顯減少，Disse腔及細(xì)胞間充滿大量膠原纖維。⑥D(zhuǎn)DR2基因和蛋白表達(dá)也隨建模進(jìn)行逐漸增加(P<0.05)。吡唑組和對(duì)照組血清及病理檢測(cè)

7、無(wú)明顯異常，DDR2僅少量表達(dá)。藥物干預(yù)或治療后的病變嚴(yán)重程度介于對(duì)照組和模型組之間。 結(jié)論 1．本實(shí)驗(yàn)成功建立了酒精性肝纖維化大鼠模型，組織病理及電鏡觀察證明建模12周出現(xiàn)纖維化，且纖維化程度隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而加重。 2．隨建模進(jìn)行，模型組DDR2基因和蛋白表達(dá)量逐漸增加，DDR2與Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ膠原及HA、CIV等均呈顯著正相關(guān)，其中與Ⅲ型膠原，HA、CIV關(guān)系最為密切。 3．復(fù)方甘草酸苷的干預(yù)或治療，