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文檔簡介
1、目的:建立酒精性肝纖維化大鼠模型,探討DDR2基因和蛋白在酒精性肝纖維化大鼠肝組織中的表達(dá)、作用及其意義,以揭示肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制;同時從血清學(xué)、組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)方面研究復(fù)方甘草酸苷對酒精性肝纖維化大鼠的干預(yù)及治療作用,為臨床治療或逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供實驗依據(jù)。 方法79口、雄性Wistar大鼠正常飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組:模型組(48只)、干預(yù)組(11只)、吡唑組(10只)和對照組(10只)。以橄欖油拌平衡飼料喂養(yǎng)大鼠
2、的基礎(chǔ)上給予胃內(nèi)灌注。①模型組:予酒精和吡嘩每日分2次灌胃。酒精的量(4-9.6g/Kg·d)及濃度(30%-60%)逐漸遞增,吡唑用量為25mg/Kg·d。②干預(yù)組:予酒精、吡唑和復(fù)方甘草酸苷(1片/Kg·d,每日分2次)灌胃,酒精和吡嘩的用法、用量同模型組。③對照組:予等量生理鹽水每日分2次灌胃。④吡唑組:予溶有吡唑的等量生理鹽水灌胃,吡唑的用法及用量同前。分別于灌胃4周、8周術(shù)時,各組隨機(jī)取1只處死,觀察肝組織病理變化。造模至12
3、周術(shù)模型組隨機(jī)取8只處死(即模型Ⅰ組),干預(yù)組(9只)、吡唑組和對照組(各8只)全部處死。以自動生化分析儀檢測肝功、血脂、血糖等指標(biāo),放免檢測血清中HA、LN、PCⅢP和CⅣ含量。取肝組織標(biāo)本,一部分行Masson染色、免疫組織化學(xué)染色(觀察Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原在肝組織中的分布)及電鏡標(biāo)本制作(觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)變化);另一部分以熒光定量-PCR和Western blot檢測DDR2基因和蛋白表達(dá)。模型組剩余大鼠繼續(xù)灌胃,至16周術(shù)再處死6
4、只(即模型Ⅱ組),余者隨機(jī)分為4組(每組8只),繼續(xù)給予原有橄欖油拌平衡飼料飲食,即①治療Ⅰ組:停止酒精及吡唑灌胃,給予復(fù)方甘草酸苷治療。②治療Ⅱ組:繼續(xù)酒精及吡唑灌胃的同時給予復(fù)方甘草酸苷治療。③治療對照組:停止酒精及吡唑灌胃,即僅有普通飲食。④未治療組(即模型Ⅲ組):繼續(xù)酒精及吡唑灌胃,不予治療。至20周末全部處死,檢測內(nèi)容同上。 結(jié)果模型組①肝組織病理觀察:模型Ⅰ組可見匯管區(qū)增生、擴(kuò)大,中央靜脈周圍輕度纖維組織增生;模型Ⅲ
5、組中央靜脈周圍及匯管區(qū)出現(xiàn)更為廣泛的纖維組織增生,相互連接成片,表現(xiàn)為中度纖維化;模型Ⅱ組病理改變介于兩者之間。②Masson染色圖像分析:模型Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組膠原的面密度逐漸升高,模型Ⅱ組和Ⅲ組之間比較有顯著差異(P<0.05)。③免疫組化染色分析:Ⅰ型膠原多位于匯管區(qū)和中央靜脈管壁,Ⅲ型膠原多見于中央靜脈周圍的肝細(xì)胞漿及纖維間隔處,Ⅳ型膠原主要位于Disse間隙內(nèi)皮下基底膜:三種膠原隨建模時間延長均逐漸增多,以Ⅰ、Ⅳ型膠原增加為主。
6、④血清AST、HA、PCⅢ等水平隨肝損傷及纖維化程度的加重逐漸升高(P<0.05),AST、ALP、HA、CⅣ的升高更為顯著(P<0.01)。⑤電鏡觀察:隨建模進(jìn)行,模型組細(xì)胞損傷逐漸加重,膠原纖維逐漸增多。模型Ⅰ組肝細(xì)胞間及竇周出現(xiàn)大量交織排列的纖維束;模型Ⅱ組肝細(xì)胞呈凋亡改變;模型Ⅲ組肝細(xì)胞微絨毛明顯減少,Disse腔及細(xì)胞間充滿大量膠原纖維。⑥D(zhuǎn)DR2基因和蛋白表達(dá)也隨建模進(jìn)行逐漸增加(P<0.05)。吡唑組和對照組血清及病理檢測
7、無明顯異常,DDR2僅少量表達(dá)。藥物干預(yù)或治療后的病變嚴(yán)重程度介于對照組和模型組之間。 結(jié)論 1.本實驗成功建立了酒精性肝纖維化大鼠模型,組織病理及電鏡觀察證明建模12周出現(xiàn)纖維化,且纖維化程度隨造模時間延長而加重。 2.隨建模進(jìn)行,模型組DDR2基因和蛋白表達(dá)量逐漸增加,DDR2與Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ膠原及HA、CIV等均呈顯著正相關(guān),其中與Ⅲ型膠原,HA、CIV關(guān)系最為密切。 3.復(fù)方甘草酸苷的干預(yù)或治療,
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