建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)腹瀉患者中的小腸結(jié)腸結(jié)腸炎耶爾森菌.pdf

1、背景:
　　 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica，Y.enterocolitica），是近20世紀(jì)80年代以來(lái)引起國(guó)際上廣泛關(guān)注的一種重要的感染性腹瀉致病菌，于1933年在美國(guó)紐約州發(fā)現(xiàn)后，曾引起數(shù)次大規(guī)模的胃腸道內(nèi)或和胃腸道外感染爆發(fā)。上個(gè)世紀(jì)80年代中期，我國(guó)曾發(fā)生2次大爆發(fā)，造成500多人感染。
　　 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種全球分布的食源性病原菌，可引起人類多種腸道癥狀，如腹瀉、腸

2、炎、腸系膜淋巴結(jié)炎以及末端回腸炎，以自限性疾病為主;還可通過(guò)淋巴系統(tǒng)播散，引起一系列腸道外并發(fā)癥狀，包括反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、心內(nèi)膜炎，敗血癥等，不僅對(duì)人類身體健康產(chǎn)生較大危害，也嚴(yán)重影響了公共衛(wèi)生，給人類以及社會(huì)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)以及醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前國(guó)內(nèi)醫(yī)院尚未把小腸結(jié)腸炎耶爾森菌列入常規(guī)的檢測(cè)項(xiàng)目中，醫(yī)務(wù)人員普遍缺乏對(duì)本菌的認(rèn)識(shí)，臨床醫(yī)生在對(duì)胃腸道疾病進(jìn)行診斷時(shí)也很少考慮小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的感染，人們可能低估了該菌感染的真實(shí)情況。

3、r>　　 目前普遍用于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測(cè)的方法有傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)和生化鑒定、普通PCR法、Real-time PCR法等。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定對(duì)污染樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)都需要經(jīng)過(guò)前期的增菌，然后再進(jìn)行分離培養(yǎng)和十幾項(xiàng)的生化鑒定，而該菌的致病數(shù)量低，培養(yǎng)增殖緩慢，分離成功率低，敏感性不高，耗時(shí)耗力，還可能耽誤臨床感染患者抗生素的使用。以PCR法為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增技術(shù)則需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，較高的檢測(cè)費(fèi)用、結(jié)果判斷繁瑣，對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)要求

4、較高等，這些特點(diǎn)使其不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層單位推廣普及使用。尋找一種新的快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)的檢測(cè)方法成為研究的熱點(diǎn)。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是近十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型的敏感、特異、方便快捷的體外恒溫鏈置換基因擴(kuò)增技術(shù)，針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下，特異、高效、快速地進(jìn)行擴(kuò)增，1

5、小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增效率可達(dá)到109-1010拷貝的數(shù)量級(jí)，終點(diǎn)產(chǎn)物檢測(cè)通過(guò)肉眼觀察即可。由于其經(jīng)濟(jì)、快速、實(shí)用而逐步應(yīng)用在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域如:病原體及其耐藥性診斷、基因診斷與治療、胚胎性別鑒定、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等?？勺鳛椴≡w所致疾病早期檢測(cè)和鑒定的一種簡(jiǎn)單而快速的診斷方法，在對(duì)條件較差的基層單位，現(xiàn)場(chǎng)，戰(zhàn)時(shí)野外環(huán)境，災(zāi)后地區(qū)病原體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)有著廣闊的應(yīng)用前景。
　　 此外，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有研究中絕大多數(shù)學(xué)者在進(jìn)行LAMP

6、條件優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)，習(xí)慣性地對(duì)試驗(yàn)體系的影響因素進(jìn)行逐一單因素優(yōu)化，繁瑣費(fèi)時(shí)，存在較大的盲目性，而且得到的單因素最佳擴(kuò)增效果組合在一起不一定是最佳的反應(yīng)組合。有學(xué)者利用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化，正交設(shè)計(jì)能成倍地減少試驗(yàn)次數(shù)，但是也要注意，正交設(shè)計(jì)之所以能成倍減少試驗(yàn)次數(shù)，是以犧牲分析各因素的部分或大部分交互作用為代價(jià)的，且正交設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)較為麻煩。
　　 析因設(shè)計(jì)（也稱全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)），即實(shí)驗(yàn)中涉及所有因素及所有水平全面組合形

7、成實(shí)驗(yàn)條件，各實(shí)驗(yàn)條件下至少做2次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。析因設(shè)計(jì)是對(duì)各因素不同水平的全部組合，故具有全面性和均衡性。析因設(shè)計(jì)的最大優(yōu)點(diǎn)是所獲得的信息量很多，可以準(zhǔn)確地估計(jì)各實(shí)驗(yàn)因素的主效應(yīng)的大小，還可估計(jì)因素之間各級(jí)交互作用效應(yīng)的大小。自從著名的英國(guó)統(tǒng)計(jì)學(xué)家Fisher于20世紀(jì)30年代創(chuàng)立析因設(shè)計(jì)并首次將其應(yīng)用在農(nóng)業(yè)試驗(yàn)中，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法至今已經(jīng)得到了充分的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，在工業(yè)、醫(yī)藥以及科學(xué)實(shí)驗(yàn)等各個(gè)方面均有其蹤跡。
　　 目的：<

8、br>　　 1.建立糞便樣本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的LAMP檢測(cè)方法，將析因設(shè)計(jì)引入LAMP反應(yīng)的條件優(yōu)化試驗(yàn)中，并對(duì)影響LAMP反應(yīng)的主要因素作進(jìn)一步分析;
　　 2.對(duì)優(yōu)化后確定的LAMP最佳反應(yīng)體系進(jìn)行特異度和靈敏度等指標(biāo)的測(cè)試，并將其應(yīng)用于臨床腹瀉樣本的實(shí)際檢測(cè)，同時(shí)聯(lián)合普通PCR做平行檢測(cè)，對(duì)所建立的LAMP方法的實(shí)際應(yīng)用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 方法：
　　 1.參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)的LAMP引物，把影響LAM

9、P反應(yīng)的主要因素FIP/BIP、MgCl2、dNTPs作為優(yōu)化對(duì)象，每個(gè)因素設(shè)定4個(gè)水平，建立4×4×4三因素析因設(shè)計(jì)表，根據(jù)設(shè)計(jì)表共進(jìn)行64組處理，每組重復(fù)2次，對(duì)128組LAMP終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行OD400測(cè)定，把測(cè)定的數(shù)值錄入SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用描述性分析和方差分析結(jié)果以及多重比較來(lái)確定最佳擴(kuò)增反應(yīng)體系，并對(duì)影響LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效果的因素順序進(jìn)行分析;
　　 2.使用純菌落DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒

10、分別對(duì)不同樣本進(jìn)行DNA提取，對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)株和11株非小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢測(cè)所建立的LAMP反應(yīng)體系的特異度。從小腸結(jié)腸炎耶爾森菌基因組DNA、純培養(yǎng)菌落、模擬感染糞便樣本三個(gè)方面對(duì)所建立的LAMP法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。
　　 3.收集廣州市某社區(qū)醫(yī)院和某二甲醫(yī)院的腹瀉病人糞便樣本，并對(duì)樣本進(jìn)行前處理和過(guò)夜冷增菌處理，提取過(guò)夜冷增菌液的DNA，使用普通PCR法和優(yōu)化后的LAMP法對(duì)收集回來(lái)的臨床腹瀉

11、患者糞便樣本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的冷增菌液標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定。比較普通PCR法和LAMP法的檢測(cè)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)的4條LAMP引物，根據(jù)4×4×4三因素析因設(shè)計(jì)表完成了64次試驗(yàn)并重復(fù)2次，根據(jù)OD400值通過(guò)描述性分析、方差分析和各因素的多重比較確定FIP/BIP、MgCl2、dNTPs的最適合組合:FIP/BIP各1.6μM，dNTPs為1.6 mM，MgCl2

12、為2.0mM。最終的LAMP最佳反應(yīng)體系，即在25μl反應(yīng)體系中， FIP/BIP各1.6μM，F(xiàn)3/B3各0.2μM，1.6 mM dNTPs，2.0mM MgCl2，8UBst DNA聚合酶，2.5μl10×Thermopol緩沖液和5μl DNA模板。擴(kuò)增程序?yàn)?63℃孵育60 min，然后80℃孵育10min。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，該LAMP反應(yīng)體系重復(fù)性好、可靠穩(wěn)定。方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IP/BIP、MgCl2、dNTPs三因素存在交互

13、效應(yīng)，各因素之間互相影響，不是單獨(dú)存在的。本試驗(yàn)條件下反應(yīng)體系中3個(gè)主要因素對(duì)LAMP擴(kuò)增效果影響從大到小依次為:FIP/BIP、Mg2+、dNTPs。
　　 2.對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以及11株非小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，僅小腸結(jié)腸炎耶爾森菌出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，其余11株非小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均為陰性，表明所建立的LAMP方法特異性好。以小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為試驗(yàn)菌株，結(jié)果用肉眼以及紫外透視儀兩種方法結(jié)合觀察，靈檢出限顯

14、示，該LAMP法對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌基因組DNA最低可檢測(cè)濃度約為38.05fg/μl;對(duì)于細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)極限約為15CFU/ml;直接對(duì)糞便樣本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行檢測(cè)限為150CFU/g。
　　 3.收集廣州市某社區(qū)醫(yī)院和某二甲醫(yī)院的腹瀉病人糞便樣本539例，對(duì)539例腹瀉患者糞便標(biāo)本進(jìn)行LAMP檢測(cè)后，成功檢出13例樣本中含有小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，普通PCR檢出11例。取13例陽(yáng)性樣本的冷增菌液進(jìn)行分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，普通

15、PCR檢出的11例陽(yáng)性樣本均能培養(yǎng)出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，LAMP法比PCR多檢出的2例陽(yáng)性樣本不能培養(yǎng)出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。以普通PCR為“金標(biāo)準(zhǔn)”，LAMP法的靈敏度為100％，特異度為99.62％，Youden指數(shù)為0.99，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值0.846，陰性預(yù)測(cè)值1.00，且與PCR法顯示了較好的一致性（McNemar檢驗(yàn)P=0.500; Kappa=0.915，P=0.000）。
　　 結(jié)論：
　　 1.析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)與方

16、差分析相結(jié)合優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，比單因素逐一試驗(yàn)的方法科學(xué)可靠，適用于LAMP反應(yīng)體系的快速優(yōu)化。
　　 2.本研究參考文獻(xiàn)針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌16S rDNA-23S rDNA間區(qū)序列設(shè)計(jì)的引物，對(duì)LAMP中的FIP/BIP、MgCl2、dNTPs三因素實(shí)現(xiàn)了成功優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化的LAMP法特異度強(qiáng)，靈敏度高，快速簡(jiǎn)便，在恒溫水浴鍋中敷浴l小時(shí)便可完成，不需要昂貴精密的儀器和繁瑣的結(jié)果判斷，通過(guò)肉眼觀察即可實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

17、。
　　 3.收集回來(lái)的腹瀉標(biāo)本進(jìn)行LAMP法檢測(cè)的過(guò)程包括過(guò)夜冷增菌、DNA提取以及LAMP法擴(kuò)增和結(jié)果判定，全部步驟不到1天便可完成，高效、快速。對(duì)腹瀉樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，LAMP法與普通PCR法顯示了良好的一致性。所建立的LAMP法適用于腹瀉樣本中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)。
　　 4.FIP/BIP、dNTPs、Mg2+對(duì)LAMP擴(kuò)增效果均有影響，三者之間存在交互效應(yīng)，使用析因分析確定LAMP最佳反應(yīng)體系，更準(zhǔn)確更合理