溫度調(diào)控球等鞭金藻3011 DHA的積累及其作用機(jī)理.pdf

1、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid; DHA)屬于人體必需的ω-3型多不飽和脂肪酸，哺乳動(dòng)物自身不能合成，必須從食物中攝取以滿足自身的需求。陸地植物DHA含量甚微，而海洋中的魚(yú)類或植物中含量豐富，因此海洋的動(dòng)植物是獲取DHA的理想來(lái)源。球等鞭金藻3011屬于海洋中的浮游植物，本身具有合成DHA的能力，同時(shí)具有生長(zhǎng)快、易調(diào)控的特點(diǎn)，成為研究和調(diào)控DHA的理想實(shí)驗(yàn)材料。本研究通過(guò)模擬高等植物逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)制，采取溫度

2、調(diào)控的方式，檢測(cè)了低溫對(duì)細(xì)胞膜的通透性和膜電位變化的影響，以確定藻細(xì)胞對(duì)溫度變化的敏感程度;同時(shí)研究了溫度對(duì)微藻的抗氧化系統(tǒng)，活性氧積累的影響;并利用RT-qPCR方法，研究低溫對(duì)DHA合成途徑中的關(guān)鍵酶表達(dá)水平來(lái)闡明低溫調(diào)控DHA含量的方法及其作用機(jī)制，為微藻源DHA產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。
　　1.細(xì)胞通透性變化:用碘化丙啶PI、親脂性陰離子熒光染料DiBAC4(3)、Ca2+敏感型熒光探針Fluo-3/AM標(biāo)記藻細(xì)胞，利用流

3、式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡檢測(cè)溫度調(diào)控對(duì)細(xì)胞膜通透性、膜電位變化和Ca2+離子通透性的影響。結(jié)果顯示:15-18℃低溫誘導(dǎo)20-24h，可使11.17±1.02％的球等鞭金藻3011細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)、促使膜的通透性發(fā)生顯著變化（P＜0.05）;同樣誘導(dǎo)條件可使38.17±0.13％的細(xì)胞膜電位發(fā)生改變，具有極顯著的變化（P＜0.01）;有58.45±5.59％藻細(xì)胞Ca2+通透性發(fā)生劇烈變化與對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01

4、)。倒置熒光顯微鏡鏡檢也與該結(jié)果基本一致。說(shuō)明溫度調(diào)控可以改變細(xì)胞通透性，以低溫誘導(dǎo)為主，高溫易誘使細(xì)胞破裂。
　　2.細(xì)胞抗氧化體系改變:通過(guò)15、18、21和24℃溫度調(diào)控，測(cè)定球等鞭金藻超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性以及還原型谷胱甘肽(GSH)、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量和藻內(nèi)活性氧含量，檢測(cè)溫度對(duì)球等鞭金藻抗氧化系統(tǒng)和ROS積累與爆發(fā)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在21℃、18℃和1

5、5℃低溫處理下，藻細(xì)胞SOD、CAT和POD活性均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì);溫度越低，峰值出現(xiàn)的越早，且峰值越大，同時(shí)峰后酶活性下降越快;GSH和MDA含量的變化趨勢(shì)與上述酶活性的變化相似;ROS水平隨著溫度的下降而升高，18℃誘導(dǎo)峰值為:14.74±0.58％，與對(duì)照組相比具顯著變化(P＜0.05)。
　　3.細(xì)胞基因表達(dá)量變化:通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物序列，對(duì)球等鞭金藻3011的脂肪酸去飽和酶基因片段進(jìn)行篩選，以RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)基

6、因的相對(duì)表達(dá)量，探索低溫對(duì)多不飽和脂肪酸去飽和酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響。結(jié)果表明:隨溫度的降低酶的表達(dá)量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，相對(duì)表達(dá)量最大值出現(xiàn)在18℃，Des4、Des5、Des6、Des8、Des9和Des12基因最大表達(dá)量分別為4.32、9.32、42.57、9.64、73.91以及5.29。
　　4.細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)改變:利用尿素包埋的方法并以DHA甲酯作為標(biāo)樣，氣相檢測(cè)DHA含量:經(jīng)18℃低溫誘導(dǎo)24h，藻細(xì)胞DHA含量

7、為0.105mg/g，高于對(duì)照組2.3倍，比18℃48h含量高出1.14倍。
　　根據(jù)以上結(jié)果說(shuō)明:球等鞭金藻3011經(jīng)過(guò)18℃低溫誘導(dǎo)24h，能夠顯著提高微藻細(xì)胞的DHA含量，其作用機(jī)制可能是低溫能夠使藻細(xì)胞膜發(fā)生去極化，并在去極化的條件下Ca2+通透性發(fā)生改變并活化了NADPH酶，引起自由氧的爆發(fā)，激活細(xì)胞的主動(dòng)防御系統(tǒng)，使微藻細(xì)胞一方面通過(guò)激活抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性清除多余的ROS，同時(shí)ROS作為信號(hào)分子，使MAPKs信號(hào)通路