2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、慢性腦積水是蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)后的常見并發(fā)癥,但具體機(jī)制不清,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床檢查顯示出血后腦積水與轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-beta1,TGF-β1)過度表達(dá)導(dǎo)致的柔腦膜纖維化、蛛網(wǎng)膜下腔細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)沉積有關(guān)。柔腦膜是蛛網(wǎng)膜和軟腦膜的合稱,二者在胚胎發(fā)育和組織分化上關(guān)系密切且均起源于神經(jīng)

2、管周圍的間充質(zhì)。蛛網(wǎng)膜下腔為蛛網(wǎng)膜與軟腦膜之間的空隙,其間有大量纖維小梁貫穿。膠原纖維為柔腦膜中最主要的成分,柔腦膜細(xì)胞間形成大量橋粒和緊密連接,構(gòu)成防止腦脊液通透的屏障。由于離體條件下柔腦膜來源的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)及細(xì)胞表面蛋白表達(dá)方面的差異性,且柔腦膜細(xì)胞具有一定的干細(xì)胞特性,因此目前認(rèn)為柔腦膜細(xì)胞是腦內(nèi)特殊的成纖維細(xì)胞。合成膠原的主要細(xì)胞可能是柔腦膜細(xì)胞,SAH后蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)柔腦膜細(xì)胞大量增生是纖維化的重要因素,膠原的主要來源可能與腦脊

3、液中炎癥因子的刺激密切相關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)的主要成分為膠原蛋白,包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型膠原等,ECM的合成與降解失衡是組織器官纖維化的基礎(chǔ)。Ⅰ型前膠原合成Ⅰ型膠原時(shí)由蛋白酶水解下來的羧基端肽稱為Ⅰ型膠原羧基端肽(procollagenⅠC-Terminal propeptide PⅠCP),Ⅲ型前膠原分泌到細(xì)胞外后被蛋白酶切下的N端肽稱為Ⅲ型膠原氨基端肽(PⅢNP),它們可作為膠原合成

4、以及纖維化的間接指標(biāo)。目前認(rèn)為,蛛網(wǎng)膜下腔出血后膠原合成包括Ⅰ型和Ⅲ型,以Ⅰ型膠原產(chǎn)生為主,柔腦膜細(xì)胞中的Ⅰ型膠原蛋白、腦脊液中的PⅠCP可作為反應(yīng)柔腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔纖維化的指標(biāo)。Masson染色可以顯示柔腦膜膠原纖維的厚度,可以作為柔腦膜纖維化的檢測(cè)方法。
  首先通過建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,檢測(cè)出血后不同時(shí)間柔腦膜細(xì)胞中miR-29a/b/c表達(dá)變化,確定miR-29c在出血后表達(dá)下降,選擇miR-29c為研究目標(biāo)。然后新

5、建大鼠SAH模型,檢測(cè)大鼠SAH后TGF-β1表達(dá)升高,miR-29c表達(dá)降低,通過慢性毒載體LV-rno-miRNA-29c成功過表達(dá)miR-29c。對(duì)比檢測(cè)腦脊液中PⅠCP含量,表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦脊液中PⅠCP含量隨柔腦膜纖維化升高,維持miR-29c過表達(dá)可下調(diào)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦脊液中PⅠCP含量。通過柔腦膜Masson染色,說明維持miR-29c過表達(dá)后柔腦膜內(nèi)膠原合成顯著降低,大鼠頭部MRI檢測(cè)顯示,對(duì)比大鼠過表達(dá)miR-

6、29c可以降低大鼠腦積水形成的比率幾率,減少腦積水的形成。體外培養(yǎng)大鼠柔腦膜細(xì)胞,培養(yǎng)液中加用外源性TGF-β1,通過小干擾RNA技術(shù)(short interfering RNA,siRNA),選擇脂質(zhì)體Lipofectamine(@)2000作為載體,并且通過轉(zhuǎn)染后Smad3抑制表達(dá)的對(duì)比,篩選samd3-rat-493作為轉(zhuǎn)染目標(biāo)。成功抑制Smad3表達(dá)后,檢測(cè)到miR-29c表達(dá)升高,柔腦膜細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白含量降低。
  

7、綜上所述,miR-29c高表達(dá)可以抑制柔腦膜纖維化,減少實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦積水的形成,并且可以通過TGF-β1/Smad3信號(hào)系統(tǒng)參與柔腦膜纖維化,抑制Smad3的表達(dá)上調(diào)miR-29c并抑制柔腦膜細(xì)胞纖維化。miR-29c將是治療或預(yù)防蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦積水可能的靶目標(biāo)。
  本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
  第一部分 miRNA-29c在實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦積水形成中的作用研究
  目的:研究miRN

8、A-29c在實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦積水形成中的作用。
  方法:建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,檢測(cè)miRNA-29a/b/c在不同時(shí)間點(diǎn)的變化,選擇miRNA-29c作為我們研究對(duì)象。建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,并通過建立miR-29c慢病毒過表達(dá)載體過表達(dá)miR-29c,檢測(cè)腦脊液中PⅠCP含量變化及柔腦膜厚度改變,以及其對(duì)腦積水形成的影響。
  1.選擇研究目標(biāo):通過立體定向儀,建立10只大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,10只空

9、白對(duì)照組大鼠。分別于建模前、建模后3天、7天、10天、14天,檢測(cè)腦膜miRNA-29a、b、c變化。確定選擇miRNA-29c作為研究對(duì)象。
  2.miRNA-29c在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的作用:
  2.1選取48只大白鼠,隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(16只)、空白慢病毒組(16只)和實(shí)驗(yàn)組(16只,LV-rno-miRNA-29c組)。全部3組行大鼠頭部MRI。建立miR-29c慢病毒過表達(dá)載體LV-rno-miRNA-2

10、9c,并通過立體定向儀將入5μL生理鹽水、空白慢病毒、實(shí)驗(yàn)組(LV-rno-miRNA-29c組)分別植入假手術(shù)組、空白病毒對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組大鼠。1周后實(shí)驗(yàn)組、空白病毒組采用枕大池二次注血法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,假手術(shù)組枕大池注入等量生理鹽水。
  2.2.3周后假手術(shù)組、空白病毒對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組行頭部MRI檢查,對(duì)比各組大鼠腦室系統(tǒng)變化。
  2.3.3周后通過PCR檢測(cè)腦脊液TGF-β1、miR-29c含量。ELLISA方

11、法檢測(cè)腦脊液實(shí)PⅠCP含量變化,Masson染色檢實(shí)驗(yàn)組大鼠柔腦膜厚度。
  結(jié)果:
  1.選擇研究目標(biāo):SAH后3、7、10、14天大鼠腦膜miR-29a含量升高,miR-29b含量不穩(wěn)定,miR-29c含量降低。我們選擇miR-29c作為研究目標(biāo)。
  2.miR-29c在SAH后腦積水中的作用
  2.1.假手術(shù)組、空白病毒對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別檢測(cè)ELLISA方法檢測(cè)腦脊液PⅠCP,顯示實(shí)驗(yàn)組(過表達(dá)miR

12、-29c)表達(dá)增加。
  2.2.Realtime PCR檢測(cè)各組柔腦膜細(xì)胞TGF-β1、miR-29c的表達(dá),實(shí)驗(yàn)組(過表達(dá)miR-29c)柔腦膜細(xì)胞中miR-29c含量增加,且實(shí)驗(yàn)組及空白病毒對(duì)照組TGF-β1含量較假手術(shù)組增加。
  2.3.磁共振檢查顯示顯示實(shí)驗(yàn)組(過表達(dá)miR-29c)較空白病毒組腦室擴(kuò)大的比例減少,假手術(shù)組未出現(xiàn)。
  結(jié)論:蛛網(wǎng)膜下腔出血可以導(dǎo)致miR-29c下降,且過表達(dá)miR-29c可

13、以抑制柔腦膜纖維化,并減少慢性腦積水的形成。
  第二部分 miR29c-TGFβ1/Smad3在柔腦膜纖維化的作用研究
  目的:研究miR-29c與TGFβ1/Smad3信號(hào)系統(tǒng)在柔腦膜纖維化中的作用。
  方法:體外培養(yǎng)大鼠原代柔腦膜細(xì)胞,培養(yǎng)液中加用TGF-β1,并通過小干擾RNA技術(shù),利用脂質(zhì)體2000(Lipo2000)轉(zhuǎn)染smad3-siRNA,抑制Smad3表達(dá),對(duì)比檢測(cè)miR-29c、柔腦膜纖維蛋白原

14、Ⅰ型的改變。建立三個(gè)實(shí)驗(yàn)組:實(shí)驗(yàn)組(5ng/ml TGF-β1+smad3-siRNA組)、內(nèi)對(duì)照組(5ng/ml TGF-β1+control-siRNA組)、空白對(duì)照組(0ng/ml TGF-β1+control-siRNA組),各組siRNA預(yù)處理24小時(shí)后,給予TGF-β1刺激48小時(shí)。行RT-PCR檢測(cè)miR-29c,WESTERN檢測(cè)smad3、Ⅰ型膠原蛋白。
  1.購買大鼠原代柔腦膜細(xì)胞,通過細(xì)胞凍存及復(fù)蘇體外培養(yǎng)

15、原代大鼠柔腦膜細(xì)胞。應(yīng)用小干擾RNA技術(shù),建立脂質(zhì)體2000(Lipo2000)轉(zhuǎn)染smad3-siRNA,加入培養(yǎng)液中抑制,siRNA預(yù)處理24小時(shí)后,給予TGF-β1刺激48小時(shí)。
  2.行RT-PCR檢測(cè)miR-29c,WESTERN檢測(cè)smad3、Ⅰ型膠原蛋白。
  結(jié)果:1.成功建立smad3-siRNA并轉(zhuǎn)染腦膜細(xì)胞,WESTERN檢測(cè)smad3較其他兩組下降,證實(shí)實(shí)驗(yàn)組siRAN-Smad3可以抑制smad3

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