分離X、Y精子純度評(píng)價(jià)方法的研究.pdf

1、動(dòng)物性別直接影響到畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，控制出生動(dòng)物性別是人們長(zhǎng)期以來研究解決的焦點(diǎn)和難點(diǎn)。性別控制是通過對(duì)動(dòng)物的正常生殖過程進(jìn)行人為干預(yù)，使雌性動(dòng)物生產(chǎn)出人們期望性別后代的一門生物技術(shù)。通過性別控制，不但可減少人類性連鎖遺傳疾病的發(fā)生，可挽救瀕臨滅絕的珍稀物種，而且可選擇不同性別的家畜，滿足畜牧生產(chǎn)需要。 為實(shí)現(xiàn)從源頭上進(jìn)行高水平性別控制，精子分離成為研究的焦點(diǎn)，而對(duì)于精子分離，無論是方法的建立，還是方法的優(yōu)化都離不開高效

2、、快速的評(píng)價(jià)體系作為技術(shù)保障，兩者相伴而生、相互依賴，所以評(píng)價(jià)方法是否完善也是學(xué)界倍加關(guān)注的焦點(diǎn)。 流式細(xì)胞儀分離X、Y精子這項(xiàng)技術(shù)標(biāo)志著X、Y精子分離技術(shù)取得很大進(jìn)步，國際上已有很多公司利用這一技術(shù)進(jìn)行X、Y精子分離與推廣，與此同時(shí)其評(píng)價(jià)技術(shù)體系也在研究探索之中并取得了很大進(jìn)步，如：流式細(xì)胞儀重分析法，單精子巢式PCR評(píng)價(jià)法。雖然還有很多技術(shù)細(xì)節(jié)有待于進(jìn)行深入探究，但隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展及科研人員的不斷努力，在提高評(píng)價(jià)方法

3、可信性的前提下，其評(píng)價(jià)手段也將會(huì)取得新的進(jìn)步，尤其是通過對(duì)單精子巢式PCR評(píng)價(jià)法各個(gè)技術(shù)參數(shù)的認(rèn)真研究，很可能取得很大的突破，減少勞動(dòng)強(qiáng)度、縮短評(píng)價(jià)過程所需時(shí)間，使本方法逐漸成熟，并最終擺脫對(duì)大型專有儀器的依賴，而成為一種常規(guī)化、低成本化的檢測(cè)手段，并促進(jìn)性控精液在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。同時(shí)簡(jiǎn)便、快捷評(píng)價(jià)方法的建立與優(yōu)化也必會(huì)促進(jìn)人類及其他X、Y染色體差異少的物種精子分離研究的突破。 本研究進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)研究： （1）首先采用

4、流式細(xì)胞儀進(jìn)行牛X、Y精子分離，然后將分離的X、Y精子分成三部分，并以其中一部分分離精液和常規(guī)精液為實(shí)驗(yàn)材料建立了單精子PCR評(píng)價(jià)法，并分別采用熒光原位雜交方法和流式細(xì)胞重分析法通過對(duì)分離精液和常規(guī)精液進(jìn)行X、Y精子比例分析對(duì)PCR方法進(jìn)行了驗(yàn)證和分析。 （2）單精子PCR鑒定分離X、Y精子純度：本部分實(shí)驗(yàn)根據(jù)Y染色體上，Sry基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，同時(shí)為防止假陰性結(jié)果出現(xiàn)，根據(jù)牛3號(hào)常染色體序列設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)標(biāo)引物，采用雙重PCR建立

5、單精子性別分析技術(shù)方法，使用單精子快速PCR技術(shù)對(duì)分離的牛X、Y精子進(jìn)行純度鑒定。本實(shí)驗(yàn)的常規(guī)快速PCR方法不但縮短了檢測(cè)分析時(shí)間，而且避免了巢式PCR易污染的現(xiàn)象。 （3）熒光原位雜交技術(shù)鑒定分離牛X、Y精子純度：本實(shí)驗(yàn)采用Y染色體上特異基因DNA序列作為探針模板制作探針，與去凝縮的精子頭進(jìn)行熒光原位雜交，對(duì)精子進(jìn)行了性別分析，有特異熒光信號(hào)的為Y精子，無特異信號(hào)的為X精子。結(jié)果由于本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)發(fā)光部位片段僅2052bp，不能在