減少水牛XY精子分離過程中損傷的相關(guān)研究.pdf

1、我國分離水牛XY精子的研究始于2002年，并已建立了一整套分離精子的技術(shù)體系，于2006年2月研究成功世界首例分離精子性別控制的試管水牛雙犢。然而，精子在分離過程中經(jīng)歷了染色、高倍稀釋、激光照射、高壓、離心和冷凍解凍等因素的作用，其活力及在體內(nèi)、外的受精能力受到影響。本研究是為了減少水牛精子在分離、冷凍過程中的細(xì)胞器損傷，提高分離精子的質(zhì)量和體外受精生產(chǎn)胚胎的效率，從而在節(jié)約成本的同時(shí)獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益，為實(shí)現(xiàn)奶水牛產(chǎn)業(yè)化推廣提供有力保

2、障。研究分為四部分，其方法和結(jié)果如下：
　　 研究一，對水牛精子在分離、冷凍過程中的運(yùn)動特性、線粒體活性、質(zhì)膜完整性及凋亡等精液品質(zhì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，以了解水牛精子在分離、冷凍過程中不同階段(新鮮、染色后、分選后和冷凍-解凍后)對精子細(xì)胞器損傷的程度，以便優(yōu)化水牛精子分離程序。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)不同品種及個(gè)體的水牛精子在分離過程中不同階段(新鮮、染色后、分離后和冷凍-解凍后)的精子運(yùn)動參數(shù)變化的結(jié)果表明，分離、冷凍程序?qū)λ?/p>

3、牛精子活力的相關(guān)參數(shù)(MOT，PMOT，VSL，VCL，VAP，BCF，LIN)均有明顯影響(p<0.05)；其中冷凍-解凍后的分離精子活力的相關(guān)參數(shù)(MOT，PMOT，VSL，VCL，VAP，BCF，LIN)數(shù)值均顯著降低(p<0.05)，說明冷凍-解凍程序?qū)Ψ蛛x精子的損傷最嚴(yán)重，影響了精子的運(yùn)動特性。另外，品種和個(gè)體對水牛精子分離、冷凍中活力的影響程度亦不同(p<0.05)。(2)利用熒光顯微鏡檢測水牛精子分離、冷凍過程對精子質(zhì)量的

4、影響，發(fā)現(xiàn)NL566水牛新鮮精子線粒體高膜電位百分率(83.50% vs65.10%，59.38%)、質(zhì)膜完整率(75.90% vs69.00%，58.66%)顯著高于染色后和冷凍-解凍后的精子(p<0.05)，而與分選后精子無顯著差異(p>0.05)；NL566水牛新鮮精子經(jīng)染色、分選和冷凍-解凍后凋亡率明顯升高(8.56% vs13.99%，14.60%，22.73%)。結(jié)果表明，在水牛精子分離、冷凍過程中，染色和冷凍-解凍會造成精

5、子線粒體和膜損傷。NL3619和ML1005水牛精子分離冷凍過程對精子質(zhì)量的影響，也得到了與NL566類似的結(jié)果。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果與熒光顯微鏡一致。(3)熒光顯微鏡法和流式細(xì)胞儀法檢測分離精子的線粒體活性(71.38% vs73.67%)、質(zhì)膜完整性(69.25% vs69.49%)和凋亡率(15.05% vs19.51%)均無差異，表明這兩種方法均能有效評估精子質(zhì)量。(4)精子的線粒體活性、質(zhì)膜完整性和凋亡間均具有相關(guān)性。
　

6、　 研究二，利用激光光鑷?yán)庾V分析水牛精子分離、冷凍過程中蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類等大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)和含量的變化，探討水牛分離精子的損傷機(jī)理，以便進(jìn)一步優(yōu)化分離、冷凍精子程序。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)隨著水牛精子分離、冷凍程序的進(jìn)行，對精子頭部的拉曼光譜分析可知，精子細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖(926 cm-1)和蛋白質(zhì)(1129、1612、1633 cm-1)含量明顯提高，而脂類(1301、1661 cm-1)含量明顯降低；精子中段部的拉曼光譜分析

7、可知，脂類(1299、1445、1654 cm-1)含量明顯降低，而糖原(936 cm-1)和蛋白質(zhì)(1125 cm-1)含量明顯提高，這可能與精子細(xì)胞器的損傷有關(guān)。且四個(gè)階段精子細(xì)胞的拉曼指紋圖譜相似，僅峰值不同，從圖形上無法有效識別這四個(gè)階段的精子細(xì)胞。經(jīng)優(yōu)化的PCA-DFA預(yù)測新鮮、染色后、分選后和冷凍-解凍后精子的靈敏度和特異性基本>90%。(2)分離、冷凍過程中同一階段，不同品種或同一品種不同個(gè)體的水牛精子的拉曼光譜檢測結(jié)果發(fā)

8、現(xiàn)，ML1005與NL566、NL3619相比，在染色后、分選后階段精子的各物質(zhì)含量略有不同，而在新鮮和冷凍-解凍后精子的各物質(zhì)含量有明顯變化，說明各個(gè)階段對不同個(gè)體的水牛精子損傷程度也會有所差異。且三頭水牛精子細(xì)胞的拉曼指紋圖譜相似，僅峰值不同，從圖形上無法有效識別這三頭牛的精子細(xì)胞。經(jīng)優(yōu)化的PCA-DFA預(yù)測NL566、NL3619和ML1005精子的特異性均>95%。
　　 研究三，添加抗氧化劑在水牛精子分離、冷凍程序的染

9、色液、分離收集液和冷凍稀釋液中，以提高分離精子的質(zhì)量。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)不同抗氧化劑27℃孵育1h、24h、48h、72h后，MLT組精子線粒體高膜電位百分率均顯著升高(p<0.05)，而PCB和IGF-Ⅰ組僅在孵育72h后，精子線粒體高膜電位百分率顯著升高(p<0.05)，說明MLT、PCB、IGF-Ⅰ均具有一定的抗氧化作用。(2)分別添加MLT、PCB和IGF-Ⅰ在水牛精子分離、冷凍過程中的染色液、分離收集液和冷凍稀釋液中，與對照

10、組相比，均能在不影響質(zhì)膜完整性和細(xì)胞凋亡的同時(shí)，顯著提高冷凍-解凍后分離精子的線粒體活性(p<0.05)。(3)分別添加MLT、PCB和IGF-Ⅰ在水牛精子分離、冷凍過程中的染色液、分離收集液和冷凍稀釋液中，檢測染色后、分選后和冷凍-解凍后精子的拉曼光譜。結(jié)果表明，在冷凍稀釋液分別添加MLT、PCB和IGF-Ⅰ，冷凍-解凍后的分離精子的拉曼光譜除歸屬糖原(頭部490 cm-1；中段部936 cm-1)和脂類(頭部1300、1661 cm

11、-1；中段部1300、1445、1655 cm-1)特征峰外，其它特征峰強(qiáng)度明顯減弱；而在染色液、分離收集液分別添加MLT、PCB和IGF-Ⅰ對染色后和分選后精子的拉曼光譜的特征峰變化不明顯。另外，在水牛精子分離、冷凍過程各稀釋液中添加抗氧化劑組與對照組的精子細(xì)胞的拉曼指紋圖譜相似，僅峰值不同，從圖形上無法有效識別這兩組精子細(xì)胞。經(jīng)優(yōu)化的PCA-DFA預(yù)測添加抗氧化劑組精子的靈敏度和特異性均>90%。
　　 研究四，將添加MLT

12、、PCB和IGF-Ⅰ的分離精子應(yīng)用于體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)系統(tǒng)，以提高水牛分離精子生產(chǎn)性控胚胎的效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)水牛卵母細(xì)胞在添加有10%ECS+FSH(0.5μg/ml)+LH(5μg/ml)+E2(1μg/ml)+EGF(10ng/ml)的成熟液基礎(chǔ)上再添加50μMCysteamine+0.3mM Cystine體外成熟培養(yǎng)24h后，進(jìn)行體外受精，其囊胚率顯著高于對照組(30.9% vs17.2%)(p<0.05)。(2)上游法和精

13、子洗滌法處理水牛分離精子體外受精后，二者的囊胚率分別為14.17%和19.33%，差異顯著(p<0.05)，說明采用精子洗滌法處理分離精子更有利于提高分離精子體外受精胚胎發(fā)育的效率。(3)添加MLT、PCB和IGF-Ⅰ的分離精子分別進(jìn)行IVF，囊胚率分別為27.21%、24.39%和21.62%，與對照組18.24%的囊胚率均有一定程度提高，且添加MLT和PCB分離精子的囊胚率與對照組差異顯著(p<0.05)。其中添加MLT的分離精子效