Ezrin相關蛋白網絡在人精子獲能過程中的功能研究.pdf

1、受精是一個新個體產生的標志，是指精子和卵子自發(fā)融合成為受精卵的過程，要完成這一過程必須具備一定的條件，精子獲能就是其中之一。獲能是指精子獲得使卵細胞受精的能力，是精子在自然狀態(tài)下完成受精過程的一個必需條件。哺乳動物的精子在受精前都要經歷獲能過程。在精子獲能過程中，對于精子質膜的修飾改變是這一過程的一個關鍵事件。但是迄今為止，對于這一重要事件分子機制的研究結果還不多，遠不能闡明這一過程。 Ezrin蛋白是ERM蛋白家族的成員之一，

2、也是該家族中被研究最多的蛋白。在體細胞中的大量研究顯示，ezrin是細胞皮質骨架蛋白與細胞質膜固有膜蛋白之間的銜接蛋白，它的主要作用是通過對骨架蛋白與膜蛋白的銜接作用，引起細胞膜表面結構的重構，從而介導包括細胞黏附、變形、微絨毛形成等一系列的細胞事件。不僅如此，活化的ezrin還能夠和Rho解離抑制因子--RhoGDI一起促進細胞表層骨架蛋白的形成，從而使actin聚合形成F-actin。因此，在體細胞中就存在一個由ezrin、acti

3、n、RhoGDI、Rho蛋白以及質膜蛋白共同形成的蛋白網絡體系。這個蛋白網絡的主要作用就是對細胞膜的表面結構進行組裝。 本實驗室在前期研究工作中發(fā)現，ezfin和RhoGDIl表達于人睪丸組織中，那么，會不會前述與ezrin相關的蛋白網絡體系也能在精子中發(fā)揮功能呢?因為在精子獲能過程中也存在膜重構的現象。我們推測，這個網絡體系可能作用于精子獲能過程中的膜重構。針對這一問題開展了以下研究：(1)用ERM家族磷酸化位點的抗體行不同獲

4、能狀態(tài)精子蛋白的Western Blot實驗，結果顯示在精子獲能過程中，ezrin第567位蘇氨酸發(fā)生了磷酸化修飾，這說明ezrin在獲能過程中被活化。推測活化后的ezrin可以與下游一系列蛋白通過直接或間接相互作用參與膜的重構，故運用一系列免疫共沉淀試驗進行驗證。(2)用免疫共沉淀方法比較獲能前后ezrin與RhoGDll相互作用情況，結果顯示，兩者的相互作用在獲能后增加；運用二維電泳結合銀染和磷酸化染色方法，結果顯示，RhoGDll

5、自身還在獲能過程中發(fā)生了磷酸化修飾，前述兩個結果均可導致RhoGDll自Rho蛋白解離下來。對后者用免疫共沉淀的方法進行驗證，結果符合預想，RhoGDll與RhoA的相互作用在獲能后減弱。這一結果提示RhoA可參與下游一系列通路導致F-actin形成。(3)對于這一系列事件的最終結果用F-actin特異性染料。Texas Red-Phalloidin染色進行分析，結果顯示，獲能后，精子的F-actin染色尤其是頭部的染色明顯增強。說明獲

6、能過程中actin聚合。(4)據體細胞中的研究，ezrin可以和F-actin相互作用，故運用Co-IP方法對ezrin和F-actin的相互作用進行分析，結果顯示獲能后ezrin與F-actin的相互作用增強。這與體細胞中的現象類似，因此我們推測ezrin還可通過其氨基端與膜相互作用。(5)篩選了一個精子膜蛋白cd44，同樣運用免疫共沉淀的方法比較其與ezrin相互作用情況，結果顯示，ezrin在獲能后與cd44相互作用增加，且ezr

7、in不僅可以和ed44的未修飾形式相互作用，還可與其糖基化修飾形式相互作用。(6)最后，分析ezrin和actin在獲能中可能的功能，分別用ezrin和actin.抗體對獲能和頂體反應進行阻斷，結果顯示，ezrin和actin抗體能夠阻斷精子獲能但對于頂體反應則沒有影響。 總之，本研究為人精子獲能分子機制提出了一個新的假說，即在人精子獲能過程中，ezrin、RhoGDll、actin、RhoA及膜蛋白可以通過相互作用形成一個蛋白