幾丁質(zhì)結合蛋白在鹵蟲休眠卵形成過程中的功能研究.pdf

1、鹵蟲，又名鹽水豐年蝦，是廣泛分布于各大洲的鹽湖或鹽田中的一種小型甲殼類生物，因其強大的適應極端環(huán)境的能力而被科學家用來作為極端生物學的研究材料。鹵蟲具有獨特的生殖模式:在環(huán)境適宜的條件下，鹵蟲行卵胎生途徑直接產(chǎn)下可游動的無節(jié)幼體;在環(huán)境惡劣的條件下，鹵蟲行卵生途徑產(chǎn)下休眠卵。休眠卵的外圍包被有一層厚實的外殼，在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的層狀結構，從外向內(nèi)分別是致密的皮質(zhì)層(Cortical layer, CL)，疏松成許多空泡結構的泡層

2、(Alveolar layer, AL)以及最內(nèi)層的胚胎表皮層(Embryonic cuticle layer，ECL)?，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)證實休眠卵殼對休眠卵抵御極端環(huán)境起著不可或缺的作用，但對于休眠卵殼的組成成分和形成機制的了解卻非常有限。
　　本研究基于卵生鹵蟲和卵胎生鹵蟲的抑制性消減雜交文庫，從中我們篩選了三個編碼包含幾丁質(zhì)結合域的基因，并分別命名為鹵蟲幾丁質(zhì)結合蛋白(Artemiaparthenogenetica chi

3、tin-binding protein，Arp-CBP)基因A，幾丁質(zhì)結合蛋白基因B，幾丁質(zhì)結合蛋白基因C。我們通過定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)其為卵生鹵蟲的特異性表達基因，并且在卵生鹵蟲胚胎發(fā)育后期mRNA大量積累。原位雜交結果表明這三個基因由胚胎細胞表達。蛋白印跡(Western blotting)實驗顯示這三個鹵蟲幾丁質(zhì)結合蛋白在休眠卵中大量累積。膠體金偶聯(lián)的免疫組化實驗進一步證實這三個蛋白特異性分布于鹵蟲休眠卵殼中的胚胎表皮層，其中Arp

4、-CBP-A蛋白分布在纖維層和外表皮膜上，Arp-CBP-B、Arp-CBP-C蛋白分布在外表皮膜和內(nèi)表皮膜上。
　　通過RNAi技術我們將Arp-CBP基因進行了體內(nèi)沉默實驗，并通過透射電子顯微鏡觀察了干涉組鹵蟲產(chǎn)下的休眠卵的卵殼形態(tài)，發(fā)現(xiàn)將Arp-CBP基因沉默后，鹵蟲休眠卵殼的胚胎表皮層發(fā)生異常，其纖維層變得疏松，外表皮膜和內(nèi)表皮膜變得不規(guī)則。進一步，我們通過體外結合活性檢測發(fā)現(xiàn)這三個幾丁質(zhì)結合蛋白都有糖結合活性，由此推測A