NESTORON較孕酮具有更強(qiáng)的潛力調(diào)節(jié)人精子獲能和頂體反應(yīng).pdf

1、目的:
　　 探討NES對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、獲能、頂體反應(yīng)有調(diào)節(jié)作用及其調(diào)節(jié)人精子獲能和頂體反應(yīng)可能的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.精子標(biāo)本采集和處理培養(yǎng):精子標(biāo)本一部分來自于自愿捐獻(xiàn)者,一部分來自于浙江省精子庫。取精者禁欲3-7天,精子的質(zhì)量符合WHO(1999)標(biāo)準(zhǔn),精漿與預(yù)溫HTF培養(yǎng)基等量混勻后,300×g離心6min,棄去上清,精子用2ml的HTF進(jìn)行懸?。痪討乙汉笤儆?5％-90％Percoll

2、間斷密度梯度離心(600×g,18 min)；所得下層活力較好精子再用約10倍HTF懸浮,300×g離心5 min；棄去上清液,再用HTF調(diào)整精子密度到2-3 X107 cells/ml。處理好的精子進(jìn)行分組,分別加入NESTORONE(10-9-10-6 M)、GABA、孕酮(PROGESTERONE；10-9-10-6M)、GABAA受體拈抗劑(BICUCULLINE)、L-型鈣離子通道抑制劑(VERAPAMIL AND NIFED

3、IPINE),獲能條件培養(yǎng)1-5hr。
　　 2.CASA評(píng)價(jià)精子活動(dòng)率和運(yùn)動(dòng)活力:計(jì)算機(jī)輔助的精液分析(CASA)分析精子活力。精子活力是指活動(dòng)精子的運(yùn)動(dòng)能力,是測(cè)定精子活動(dòng)能力的定性方法；精子活動(dòng)率是指精子總數(shù)中活精子所占比例,是測(cè)定活精子和死精子的定量方法。精子活動(dòng)力與活動(dòng)率取決于有鞭毛運(yùn)動(dòng)精子的百分率。
　　 3.精子獲能和頂體反應(yīng)的評(píng)價(jià):精子培養(yǎng)后,4％多聚甲醛固定人精子作CTC染色。用一種可與DNA結(jié)合的熒光

4、染料Hochest33258(H258)對(duì)精子進(jìn)行預(yù)染色,避免死精子或細(xì)胞碎片影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以精子與金霉翥(CTC)熒光結(jié)合類型為指標(biāo)來評(píng)價(jià)精子獲能情況。
　　 4.精子穿通去透明帶倉鼠卵子:哺乳動(dòng)物卵子的透明帶在異種動(dòng)物的精卵細(xì)胞受精過程中起著重要的障礙作用。Yanagimachi等人發(fā)現(xiàn)用酶可除去倉鼠卵的透明帶,人精子能夠使去透明帶倉鼠卵受精,形成雄性原核,用倉鼠卵替代人卵可用來估計(jì)人精子的受精能力。
　　 5.免疫

5、熒光:處理好的人精子標(biāo)本加入分別含有NES和P4的培養(yǎng)基培養(yǎng)3hr,培養(yǎng)后4％多聚甲醛固定過夜,調(diào)精子密度1-2×107 cells/ml,精子標(biāo)本涂于經(jīng)過多聚賴氨酸處理過的玻片；濕盒晾干玻片；PBS洗玻片3次,每次5分鐘；BSA封閉精子標(biāo)本1hr；PBS洗玻片3次,每次5分鐘；一抗過夜；PBS洗玻片3次,每次5分鐘；加二抗暗盒1hr；蓋蓋玻片暗盒保存以備觀察結(jié)果。
　　 6.精子胞內(nèi)鈣離子測(cè)定:人精子在37℃培養(yǎng)5小時(shí)使其充分

6、獲能,培養(yǎng)后的精子加Fura-2/AM避光37℃培養(yǎng)30分鐘,沖洗300×g3次每次5分鐘,洗去細(xì)胞外自由Fura-2/AM。精子密度調(diào)至10-20×106個(gè)/ml。負(fù)載Fura-2/AM精子,采用340納米和380納米(發(fā)射光波長(zhǎng)510納米)的激發(fā)波長(zhǎng),每20秒取一次結(jié)果(Shimadzu RF-540 Spectroflurometer,Shimadzu Co,Kyoto,Japan)。熒光強(qiáng)度(F340/F380)來評(píng)價(jià)[Ca2+

7、]i。
　　 結(jié)果:
　　 NES顯著促進(jìn)人精子的超激活運(yùn)動(dòng)和精子尾部酪氨酸蛋白磷酸化；NES調(diào)節(jié)人精子獲能(MEC=10-9M；EC50=9.5±1.0nM)作用強(qiáng)于孕酮P4(MEC=10-7M,EC50=237.1±2.4 nM.)；NES促進(jìn)人靜穿透去透明帶卵子；NES所致人精子獲能作用能被荷包牡丹堿和木防已苦毒素阻斷；氯離子和鈣離子是NES調(diào)節(jié)精子獲能所必須的；精子培養(yǎng)5h獲能后,獲能后精子NES和P4誘發(fā)精子A