馬鹿精子體外獲能及獲能前后超微結(jié)構(gòu)變化的研究.pdf

1、精子獲能是哺乳動物受精前必須經(jīng)歷的一個(gè)成熟過程，所以精子的體外獲能便是實(shí)現(xiàn)體外受精的一個(gè)重要前提。本研究以馬鹿為試驗(yàn)對象，開展了對鹿精子體外獲能以及獲能前后精子超微結(jié)構(gòu)變化的研究，以期篩選出在實(shí)踐中具有可操作性且效果良好的馬鹿精子獲能培養(yǎng)體系，從而為鹿體外受精和受精機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。 對馬鹿精子，使用上浮法誘導(dǎo)其獲能，通過對頂體染色測定精子的頂體反應(yīng)率并作為主要指標(biāo)，同時(shí)以精子活力、精子存活時(shí)間和異種受精率為輔助指標(biāo)，對精子的

2、獲能效果進(jìn)行評價(jià)，以比較不同培養(yǎng)溫度、丙酮酸鈉濃度、咖啡因濃度、肝素濃度以及培養(yǎng)基對馬鹿精子體外獲能效果的影響。研究結(jié)果如下： 1.采用上浮法可使馬鹿的精子體外獲能。其中精液與洗精液的適宜比例為1：3～5；兩次離心洗滌時(shí)的速度和時(shí)間以2200rpm×10min和2000rpm×5min為宜。2.使用改進(jìn)的三色染色法可以有效地評價(jià)馬鹿精子獲能后的頂體反應(yīng)水平。3.馬鹿精子于5％CO2、飽和濕度下獲能培養(yǎng)，38.5℃時(shí)的頂體反應(yīng)率極

3、顯著高于37℃時(shí)的頂體反應(yīng)率(P＜0.01)。4.BO液中丙酮酸鈉的濃度從0.5mM提高至1.25mM時(shí)，頂體反應(yīng)率顯著降低(P＜0.05)。5.選擇TALP為基礎(chǔ)液對馬鹿精子體外獲能培養(yǎng)，項(xiàng)體反應(yīng)率顯著高于BO液(Ⅰ)與BO液(Ⅲ)(P＜0.05)；而BO液(Ⅰ)與BO液(Ⅲ)相比差異不顯著(P＞0.05)。6.以TALP為基礎(chǔ)液，結(jié)合使用6mg/mlBSA和10μg/ml肝素，5mM咖啡因的作用效果與0mM、2.5mM和10mM的相

4、比，頂體反應(yīng)發(fā)生率較高(P＜0.05)；但在肝素濃度提高至20μg/ml和3μg/ml時(shí)，2.5mM和5mM的咖啡因作用效果無顯著差異(P＞0.05)。7.以TALP為基礎(chǔ)液，結(jié)合使用6mg/mlBSA和2.5mM咖啡因，30μg/ml肝素的作用與10μg/ml和20μg/ml的相比，頂體反應(yīng)發(fā)生率較高(P＜0.05)；當(dāng)咖啡因濃度提高至5mM時(shí)，10μh/ml肝素的作用與30μg/ml的相比，頂體反應(yīng)發(fā)生率較高(P＜0.05)。8.m

5、KRB和高滲液都能使馬鹿精子體外獲能，但與同一培養(yǎng)條件下(38.5℃、5％CO2、飽和濕度)的其他試驗(yàn)組相比，頂體反應(yīng)發(fā)生率低(P＜0.05或P＜0.01)。9.十五組試驗(yàn)方案中對馬鹿精子體外獲能培養(yǎng)效果較好(P＜0.05)的是：試驗(yàn)二、試驗(yàn)九、試驗(yàn)十、試驗(yàn)十一的方案。 獲能處理前后的馬鹿精子經(jīng)固定、脫水、置換、包埋和聚合，用超薄切片機(jī)切片，再用醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染片，最后于透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)的變化。觀察的結(jié)果表明：

6、 1.在電子顯微鏡下，馬鹿精子由頭部、頸部和尾部3部分組成。頭部呈棒狀，絕大部分被濃縮而電子密度較高的精核所占據(jù)；頂體似帽狀扣在精核之上，約占頭部的2/3左右，其前部較為膨大；頸部位于頭部和尾部之間，這個(gè)區(qū)域較短；尾部可分為中段、主段和終段。2.馬鹿尾部軸絲的結(jié)構(gòu)類型為“9+2”；終段的微管結(jié)構(gòu)類型為“9+9+2”。3.馬鹿精子獲能前，精子頭部質(zhì)膜和頂體完整。精子獲能后，有的頂體質(zhì)膜局部膨脹并呈泡狀，有的斷裂和丟失。頂體膨脹，外膜內(nèi)