基于雜交鏈反應(yīng)的熒光放大策略及其應(yīng)用研究.pdf

1、蛋白質(zhì)類藥物可分為多肽、單克隆抗體、重組疫苗和基因工程藥物等。相比于傳統(tǒng)的小分子藥物而言，蛋白質(zhì)類藥物具有活性高、特異性強(qiáng)、毒性低、生物功能明確的特點(diǎn)。由于蛋白質(zhì)類藥物的體內(nèi)代謝十分復(fù)雜，生物體內(nèi)還存在內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，同時(shí)該類藥物用藥劑量小，體液中藥物濃度極低，因此，檢測(cè)方法必須具有極高的靈敏度和特異性。此外，有些蛋白質(zhì)類藥物除具有治療作用之外，同時(shí)可以作為疾病診斷的標(biāo)志物。能夠簡(jiǎn)便、快速地從生物樣品中靈敏、可靠地檢測(cè)痕量的蛋白質(zhì)，對(duì)

2、疾病的早期診斷、疾病發(fā)展程度的監(jiān)測(cè)、以及用藥劑量的調(diào)整具有重要的意義。
　　近年來(lái)，以核酸擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)構(gòu)建的蛋白質(zhì)靈敏分析方法為其在生物樣本中的定量分析提供了有力的工具和方法。其中，雜交鏈(hybridization chain reaction，HCR)作為一種全新的信號(hào)擴(kuò)增方法受到了廣泛關(guān)注。與傳統(tǒng)的核苷酸擴(kuò)增技術(shù)所不同的是，HCR是利用互補(bǔ)的、動(dòng)力學(xué)受限的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的不斷雜交而實(shí)現(xiàn)鏈的延伸，該反應(yīng)中的DNA片段不是被復(fù)制，而

3、是不斷的發(fā)生自組裝反應(yīng)。也就是說(shuō)，HCR可以在無(wú)酶的條件下實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增，這就為建立新型的無(wú)酶、等溫?cái)U(kuò)增方法提供了思路。
　　鑒于HCR方法的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用的可行性，本課題以HCR信號(hào)擴(kuò)增為基礎(chǔ)，構(gòu)建了新型熒光傳感器，并用于生物樣本中蛋白質(zhì)的靈敏檢測(cè)。本文分為三個(gè)部分:
　　本文第一章為緒論部分，概述了蛋白質(zhì)類藥物檢測(cè)的意義、背景、原理、檢測(cè)方法以及現(xiàn)階段存在的問(wèn)題。并介紹了單分子分析方法在定量檢測(cè)中的應(yīng)用。
　　本文第

4、二章，利用HCR信號(hào)擴(kuò)增方法和磁納米顆粒的富集作用，構(gòu)建了一種超靈敏的蛋白質(zhì)熒光分析策略。在該設(shè)計(jì)中，利用磁納米顆粒實(shí)現(xiàn)了抗原與擴(kuò)增DNA一對(duì)多的預(yù)放大，隨后，利用磁納米顆粒上富集的大量引物鏈觸發(fā)多個(gè)HCR反應(yīng)，形成長(zhǎng)的雙螺旋DNA結(jié)構(gòu)。使用SYBR GreenⅠ作為雙鏈DNA的內(nèi)插染料，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)的超靈敏檢測(cè)。在最佳反應(yīng)條件下，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，線性范圍為5.0×10-17mol/L到1.0×10-12mol/L，檢測(cè)限為1.4

5、×10-17mol/L。該方法特異性好，并可以對(duì)人血清樣本中目標(biāo)蛋白的進(jìn)行定量分析。
　　本文第三章，利用HCR信號(hào)擴(kuò)增方法結(jié)合單分子檢測(cè)技術(shù)構(gòu)建了一種全新的蛋白質(zhì)定量策略，并應(yīng)用于腫瘤壞死因子-α。該方法在形成的夾心免疫復(fù)合物上結(jié)合鏈酶親和素，利用鏈酶親和素的多位點(diǎn)特點(diǎn)延伸出三條可以觸發(fā)HCR反應(yīng)的引物鏈，誘導(dǎo)發(fā)卡探針自組裝形成長(zhǎng)的雙螺旋產(chǎn)物。以SYBR GreenⅠ作為內(nèi)插染料，利用倒置落射顯微鏡觀察基底上的亮點(diǎn)，以計(jì)數(shù)的方式