淫羊藿苷對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)假體周?chē)侨芙庖种谱饔玫难芯?pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 鈦顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨骨溶解模型的建立和評(píng)價(jià)
　　目的:建立鈦(Ti)顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解模型,模擬磨損顆粒誘導(dǎo)假體無(wú)菌性松動(dòng)的病理過(guò)程。
　　方法:7-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠20只,隨機(jī)分為兩組:(A)對(duì)照組;(B)Ti組。Ti組小鼠接受手術(shù)將無(wú)菌去內(nèi)毒素的Ti顆粒5毫克植入小鼠顱骨骨面上誘導(dǎo)骨溶解;對(duì)照組小鼠接受相同的手術(shù)步驟,但將無(wú)菌生理鹽水置于顱骨骨面作為對(duì)

2、照。兩周后所有小鼠過(guò)量麻醉處死,取顱骨標(biāo)本做研究使用。以顱骨骨面冠、矢狀縫交點(diǎn)為中心選中直徑為5mm的圓形“感興趣區(qū)域(ROI)”作為研究對(duì)象。蘇木精伊紅(H&E)染色法檢測(cè)兩組顱骨標(biāo)本中骨溶解及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況,Paint.NET軟件測(cè)量骨膜厚度,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠顱骨ROI區(qū)域體外培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的含量,實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)法檢測(cè)TN

3、F-α、IL-1β基因mRNA轉(zhuǎn)錄量。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)動(dòng)物死亡。顱骨標(biāo)本大體觀察見(jiàn)局部皮膚組織無(wú)紅腫、滲液、皮疹及流膿等;Ti覆蓋顱骨骨面粗糙,凹凸不平。H&E染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ti組小鼠顱骨骨面有明顯的蟲(chóng)蝕樣改變,骨膜內(nèi)可見(jiàn)大量細(xì)胞浸潤(rùn),炎性細(xì)胞居多,成纖維細(xì)胞較少。Paint.NET軟件測(cè)量結(jié)果表明Ti組小鼠顱骨骨膜增厚為(0.30±0.03)mm,與對(duì)照組(0.06±0.01)mm比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

4、ELISA結(jié)果顯示Ti組顱骨培養(yǎng)上清中TNF-α,IL-1β含量分別為(1440.12±82.33)ng/l和(872.13±42.39)ng/l,與對(duì)照組(235.01±35.41)ng/l和(140.02±21.07)ng/l比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)Ti刺激后, Ti組顱骨標(biāo)本中TNF-α,IL-1β基因mRNA含量增多至7.31±0.40和9.62±0.85,與對(duì)照組(標(biāo)準(zhǔn)化為1)比較,差異

5、有顯著性意義(p<0.05)。
　　結(jié)論:Ti顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解模型簡(jiǎn)單、可重復(fù)強(qiáng),能較為準(zhǔn)確的模擬關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)的病理過(guò)程。
　　第二部分 淫羊藿苷對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)骨溶解的影響
　　目的:探討淫羊藿苷(IC)對(duì)Ti顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨骨溶解的治療作用及其機(jī)制。
　　方法:7-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠80只,隨機(jī)分為四組:(A)對(duì)照組,(B)IC組,(C)Ti+安慰劑組,(D)Ti+IC組。C和D組Ti

6、顆粒植入小鼠顱骨上建立骨溶解模型,A及B組小鼠僅接受相同的手術(shù)步驟,無(wú)Ti顆粒植入。建模當(dāng)天B組和D組小鼠以IC(200毫克/千克/天)灌胃給藥,A和C組以相同劑量安慰劑(PBS)治療,兩周后所有小鼠過(guò)量麻醉處死,取顱骨備用。利用micro-ct掃描不同處理組ROI區(qū)域,根據(jù)三維重建圖像觀察各組小鼠顱骨表面溶骨餡窩數(shù)量,CT自帶軟件定量計(jì)算顱骨標(biāo)本ROI區(qū)域骨量(BV),骨礦化密度(BMD),骨表面積(BS),骨表面積/骨量比率(BS/

7、BV);H&E染色法檢測(cè)骨溶解及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況,Paint.NET軟件測(cè)量骨膜厚度;TRAP染色檢測(cè)成熟破骨細(xì)胞;免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)RANKL和RANK的表達(dá)變化;ELISA檢測(cè)顱骨培養(yǎng)上清中TNF-α,IL-1β的含量;QRT-PCR檢測(cè)RANKL、 RANK、TNF-α和IL-1β基因mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1. Micro-CT三維重建圖像顯示對(duì)照組未放置Ti顆粒的小鼠顱骨表面光滑,未見(jiàn)明顯的骨溶解跡象

8、,而Ti+安慰劑組小鼠顱骨骨面蝕骨現(xiàn)象明顯,骨溶解陷窩密布;相較于Ti+安慰劑組,Ti+IC組小鼠經(jīng)IC口服治療后溶骨現(xiàn)象得到遏制,蝕骨陷窩數(shù)量明顯減少。
　　Micro-CT3D分析定量檢測(cè):對(duì)照組中BV,BMD,BS,BS/BV值分別為(3.79±0.23)mm3,(0.71±0.05)mg/mm2,(35.71±1.98)mm2,(9.41±1.06)1/mm。Ti+安慰劑組中 BV,BMD值降至(2.03±0.12)mm3

9、,(0.58±0.03)mg/mm2,BS, BS/BV值增高至(45.73±3.84)mm2,(22.50±2.31)1/mm,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);經(jīng)IC口服干預(yù)后,Ti+IC組中BV,BMD值增至(3.51±0.23)mm3,(0.69±0.04)mg/mm2,BS,BS/BV值降至(37.21±1.98)mm2,(10.57±1.29)1/mm,與Ti+安慰劑組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。<

10、br>　　2.H&E染色:對(duì)照組骨膜內(nèi)細(xì)胞總量較少,成纖維細(xì)胞居多,炎性細(xì)胞較少,骨膜較薄;Ti+安慰劑組骨膜內(nèi)可見(jiàn)大量細(xì)胞浸潤(rùn),炎性細(xì)胞居多,成纖維細(xì)胞較少。Paint.NET軟件測(cè)量結(jié)果表明對(duì)照組、IC組、Ti+安慰劑組、Ti+IC組顱骨骨膜厚度分別為(0.07±0.01)mm,(0.06±0.01)mm,(0.28±0.04)mm,(0.12±0.02)mm。Ti+安慰劑組與對(duì)照組相比差異有顯著性意義(P<0.05);Ti+IC組

11、與Ti+安慰劑組相比差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　3. TRAP染色結(jié)果顯示,Ti+安慰劑組可見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞胞漿呈紫紅色、細(xì)胞核3個(gè)以上的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞,對(duì)照組和IC組陽(yáng)性深染多核細(xì)胞較少;各組多核細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示:對(duì)照組(5.0±1.3)個(gè),IC組未檢出,Ti+安慰劑組(36.0±4.8)個(gè),Ti+IC組(11.0±2.3)個(gè), Ti+安慰劑組與對(duì)照組, Ti+IC組與Ti+安慰劑組相比較,差異有顯著性意義(P<0.05)。

12、IC顯著減少Ti顆粒誘導(dǎo)的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞形成。
　　4. ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示:對(duì)照組上清中TNF-α和 IL-1β蛋白濃度分別為(237.13±37.36)ng/l和(133.09±19.64)ng/l;Ti+安慰劑組中,二者濃度增長(zhǎng)至(1447.52±78.23)ng/l和(889.14±45.94)ng/l,與對(duì)照組相比,差異有顯著性意義(P<0.05);Ti+IC組TNF-α和 IL-1β濃度下降至(568.86±42

13、.32)ng/l和(279.39±19.44)ng/l,與Ti+安慰劑組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.免疫組化染色顯示:相較于對(duì)照組,Ti+安慰劑組中RANKL、RANK陽(yáng)性深染位點(diǎn)分布密集,區(qū)域廣泛,Ti+IC組中陽(yáng)性深染位點(diǎn)分布稀疏,區(qū)域狹窄。這表明鈦顆粒誘導(dǎo)RANKL、RANK蛋白表達(dá)上調(diào),IC通過(guò)減少RANKL、RANK表達(dá)量抑制骨溶解。
　　6.實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)分析

14、顯示:設(shè)定對(duì)照組TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)量為1,IC組中二者表達(dá)量分別為0.81±0.13,0.83±0.12; Ti+安慰劑組為7.60±0.60;9.80±0.94;Ti+IC組為2.40±0.18;2.10±0.23;與對(duì)照組相比,Ti+安慰劑組中TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)量上調(diào)明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);經(jīng)IC治療后,Ti+IC組TNF-α和IL-1β基因轉(zhuǎn)錄量下調(diào)顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

15、5)。這表明,淫羊藿苷對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)骨溶解的抑制作用涉及TNF-α和IL-1β基因下調(diào)。
　　Ti+安慰劑組中RANKL和RANK轉(zhuǎn)錄量分別為9.02±1.05,11.01±0.97,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RANKL和RANK mRNA轉(zhuǎn)錄量在Ti顆粒刺激下明顯上調(diào)。相反的,Ti+IC組中IC干預(yù)治療后RANKL和RANK基因表達(dá)量顯著減少為2.50±0.36,3.03±0.31,與Ti+安慰劑組相比,差異