神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓神經(jīng)型一氧化氮合酶多樣性的鑒定與分析.pdf

1、背景:神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損傷或功能異常所導(dǎo)致的痛覺(jué)異?；蛲从X(jué)過(guò)敏。創(chuàng)傷、缺血性損傷、感染或炎癥、腫瘤、藥物和壓迫等原因均可以引起神經(jīng)病理性疼痛。非甾體類抗炎藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥治療神經(jīng)病理性疼痛的效果差，臨床上常使用三環(huán)類抗抑郁藥和抗癲癇藥物進(jìn)行治療，但療效差，副作用大，能夠有效緩解50％以上疼痛癥狀的患者不足50％。 神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)在的研究多集中在外周初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元和脊髓痛覺(jué)傳遞神經(jīng)元的變化上，所以從

2、解剖上被分為外周和中樞致痛機(jī)制；也有作者根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)變化的可逆性與否將神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制分為激活階段、調(diào)節(jié)階段和和修改階段。 神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制復(fù)雜，在研究中有相互矛盾的結(jié)果，一方面研究表明，神經(jīng)病理性疼痛過(guò)程中，痛覺(jué)傳入神經(jīng)元末梢在脊髓中釋放大量谷氨酸，谷氨酸通過(guò)激活NMDA受體提高痛覺(jué)傳遞神經(jīng)元的興奮性，并且NMDA受體鄰近的NOS被NMDA受體內(nèi)流的Ca2+所激活，NOS合成的NO可透過(guò)細(xì)胞膜彌散至突觸前膜加速谷氨酸釋放

3、，促進(jìn)疼痛產(chǎn)生；另一方面也有研究表明，NOS及其合成的NO介導(dǎo)了嗎啡、可樂(lè)定等藥物的鎮(zhèn)痛作用，抑制NOS的活性可以減弱它們的鎮(zhèn)痛作用。 為了探討產(chǎn)生這種結(jié)果相互矛盾的原因，本研究選擇適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型，根據(jù)脊髓中nNOS、iNOS和eNOS三種一氧化氮合酶的表達(dá)及活性變化，選擇一種具有重要調(diào)節(jié)作用的一氧化氮合酶，闡明NOS在神經(jīng)病理性疼痛中的多樣性與復(fù)雜性。 方法:1.比較慢性坐骨神經(jīng)縮窄損傷(CCI)、脊神經(jīng)

4、結(jié)扎(SNL)、保留性神經(jīng)損傷(SNI)三種神經(jīng)病理性疼痛模型產(chǎn)生疼痛的效果，分析三種大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型脊髓水平致痛機(jī)制，選擇一種適合本研究需要的動(dòng)物模型。150g～200g的SD大鼠19只，隨機(jī)分為四組(對(duì)照組、CCI組、SNL組、SNI組)，對(duì)照組(n=4)切開(kāi)左后肢皮膚和肌肉，暴露坐骨神經(jīng)后立即縫合，作為參照。CCI組(n=4)、SNL組(n=4)和SNI組(n=7)分別于左后肢制作CCI、SNL、SNI疼痛模型。術(shù)前3d至術(shù)

5、后11d隔日使用機(jī)械和熱輻射刺激測(cè)定術(shù)側(cè)后趾，比較它們對(duì)疼痛刺激的反應(yīng)差異。術(shù)后15d測(cè)痛后，使用4％多聚甲醛灌注大鼠，取L5,6脊髓，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)；采用抗原癌基因蛋白c-Fos、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白(GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白(OX-42)抗體分別檢測(cè)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀況。 2.檢測(cè)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中MEK-ERK與NF-kappaB信號(hào)途徑的變化，探討增加一氧化氮合酶表達(dá)的信號(hào)途徑。雌性S

6、D大鼠12只，體重150～200g，隨機(jī)分為2組(n=1O)，對(duì)照組和SNI組。對(duì)照組實(shí)施假手術(shù)，SNI組于左肢制備坐骨神經(jīng)保留性神經(jīng)損傷模型(SNI)。分別于術(shù)前3d、術(shù)后即刻、術(shù)后1、3、5、7、9、11d測(cè)定大鼠對(duì)機(jī)械刺激產(chǎn)生縮腿反應(yīng)的次數(shù)。術(shù)后11d痛覺(jué)測(cè)定后，每組取3只大鼠用于灌注，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脊髓MEK、p-MEK、p-ERK、NF-kappaB的表達(dá)；余下3只大鼠斷頭處死后分離L4-6脊髓，提取大鼠脊髓的蛋白質(zhì)

7、，應(yīng)用WesternBlot方法檢測(cè)p-MEK、p-ERK、NF-kappaB表達(dá)。 3.比較神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型脊髓中神經(jīng)型(nNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)三種一氧化氮合酶的表達(dá)及活性變化，評(píng)價(jià)它們?cè)谔弁粗械恼{(diào)節(jié)作用。雌性SD大鼠(150～200g)20只，隨機(jī)分為2組，每組10只，分別為對(duì)照組和SNI組。對(duì)照組大鼠暴露坐骨神經(jīng)后立即縫合手術(shù)切口，SNI組大鼠于左后肢制備坐骨神經(jīng)保留性損傷(SNI)模型。

8、術(shù)后測(cè)定疼痛的變化，確定疼痛模型成功后，于術(shù)后第14日斷頭處死大鼠，截取L4～6段脊髓，分離左右側(cè)脊髓，于-80℃儲(chǔ)存對(duì)照組手術(shù)側(cè)、SNI組手術(shù)側(cè)和非手術(shù)側(cè)脊髓備用。對(duì)照組和SNI疼痛模型組各取5只大鼠脊髓，使用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增nNOS、eNOS和iNOS片段，以β-actin作為內(nèi)參照，比較SNI組與對(duì)照組NOS表達(dá)的相對(duì)差異。每組余下5只大鼠脊髓于冰上迅速勻漿，分別檢測(cè)組成型和誘導(dǎo)型NOS的活性。 4.分析神經(jīng)病理性疼痛

9、大鼠脊髓中NR2B、nNOS和PSD95受體的表達(dá)變化，了解神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中nNOS和NMDA受體在功能上的協(xié)調(diào)性是否具有結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。雌性SD大鼠12只，體重150～200g，隨機(jī)分為兩組(n=6)，分別為對(duì)照組和SNI組。SNI組于左肢制備坐骨神經(jīng)保留性神經(jīng)損傷模型(SNI)，對(duì)照組為假手術(shù)組。分別于術(shù)前3d、術(shù)后即刻、術(shù)后1、3、5、7、9、11d測(cè)定大鼠對(duì)機(jī)械刺激產(chǎn)生縮腿反應(yīng)的次數(shù)。術(shù)后11d，每組取3只大鼠用于灌注，應(yīng)用免

10、疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脊髓NR2B和nNOS的表達(dá)；每組余下3只大鼠斷頭處死后分離L4-6段脊髓，提取組織RNA，采用RT-PCR方法檢測(cè)PSD95的轉(zhuǎn)錄水平。 5.研究神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角神經(jīng)型一氧化氮合酶的多樣性，比較不同nNOS表達(dá)的變化。雌性SD大鼠20只，體重150～200g，隨機(jī)分為2組(n=10)，對(duì)照組和SNI組。對(duì)照組實(shí)施假手術(shù)，SNI組于左肢制備坐骨神經(jīng)保留性神經(jīng)損傷模型(SNI)。術(shù)前3d、術(shù)后即刻、術(shù)后

11、1、3、5、7、9、11d測(cè)定大鼠對(duì)機(jī)械刺激產(chǎn)生縮腿反應(yīng)的次數(shù)。術(shù)后11d痛覺(jué)測(cè)定后，每組取3只大鼠用于灌注，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脊髓nNOS的表達(dá)。每組余下7只大鼠斷頭處死后分離L4-6脊髓：提取其中3只大鼠脊髓的蛋白質(zhì)，應(yīng)用抗nNOS羧基端抗體和WesternBlot方法檢測(cè)nNOS的表達(dá)；提取其中4只大鼠脊髓的RNA，1只大鼠脊髓RNA進(jìn)行RACE-PCR和SouthernBlot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)nNOS不同的mRNA，余下3只大鼠脊

12、髓的RNA用于檢測(cè)不同nNOS的mRNA變化。 6.比較轉(zhuǎn)染nNOSα或nNOSβ的PC12細(xì)胞NF-kappaB轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞周期的改變，探討nNOSα或nNOSβ在功能上的差異性。將攜帶nNOSα或nNOSβ基因的pcDNA3.0表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(由H5α細(xì)菌制作)，在H5α細(xì)菌中擴(kuò)增后，提純質(zhì)粒酶切鑒定。將攜帶nNOSα或nNOSβ基因的pcDNA3.0表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，G418篩選，使用抗nNOS

13、羧基端的抗體，通過(guò)免疫組織化學(xué)和westernblot方法檢測(cè)nNOS的表達(dá)效率。提取經(jīng)篩選PC12細(xì)胞的核蛋白，采用EMSA凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞核NF-kappaB轉(zhuǎn)錄活性。經(jīng)篩選PC12細(xì)胞經(jīng)PI染色后流式細(xì)胞儀分選，測(cè)定凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。 結(jié)論:研究表明組成型和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶合成一氧化氮的能力具有差別，產(chǎn)生不同濃度的一氧化氮，對(duì)組織或細(xì)胞發(fā)揮不同的作用；本研究顯示細(xì)胞膜上的nNOSα和細(xì)胞漿里的nNOSβ截然相反地

14、調(diào)節(jié)NF-kappaB的轉(zhuǎn)錄活性；由此可以推斷：一氧化氮不僅從不同濃度，而且在細(xì)胞不同部位對(duì)細(xì)胞的生理功能或病理改變有不同的影響。 研究表明神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角神經(jīng)元NF-kappaB活性增加，COX-2和nNOS表達(dá)升高，導(dǎo)致中樞敏化；本研究顯示神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中增強(qiáng)NF-kappaB活性的nNOSα表達(dá)升高，而降低NF-kappaB活性的nNOSβ表達(dá)減弱；因此可以認(rèn)為神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOSα和nNO